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专利号: 2023113916886
申请人: 河北农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-05-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种CRISPR/Cas12a基因编辑系统,其特征在于,所述CRISPR/Cas12a基因编辑系统包括1307‑2hyg‑LbCas12a‑crRNA质粒;

所述1307‑2hyg‑LbCas12a‑crRNA质粒包含1307‑flag载体、hyg基因、Cas12a基因、crRNA序列;所述1307‑flag表达载体多克隆位点插入了trpC启动子启动的hyg表达盒,在hyg表达盒前方插入了带有Tef启动子Cas12a基因表达盒、在Cas12a基因表达盒前方通过基因合成的方式插入了带U3启动子启动的crRNA表达盒;

编码所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的基因编辑系统,其特征在于,编码所述1307‑flag载体序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的基因编辑系统,其特征在于,编码所述hyg基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述的基因编辑系统,其特征在于,编码所述Cas12a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.权利要求1所述一种CRISPR/Cas12a基因编辑系统在基因编辑灰葡萄孢中的应用,其特征在于,所述基因编辑方法包括以下步骤:

1)将所述CRISPR/Cas12a基因编辑系统中的1307‑2hyg‑LbCas12a‑crRNA质粒导入灰葡萄孢中,使得1307‑2hyg‑LbCas12a‑crRNA质粒上的hyg基因、Cas12a基因表达、crRNA转录加工修饰成茎环结构;

2)Cas12a蛋白会识别所述茎环结构与crRNA形成复合物,所述复合物会靶向编辑基因并锚定在灰葡萄孢需要编辑的基因上;

3)锚定后Cas12a蛋白会发挥DNA切割活性,对灰葡萄孢的DNA进行定点切割,产生DSB断裂,此时灰葡萄孢会发挥自身的修复系统对其进行NHEJ修复,形成敲除突变体,从而完成对灰葡萄孢的基因编辑过程;

4)对突变体进行验证及表型和致病力分析。