1.一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统在敲除赤霉菌细胞大片段比卡菌素基因簇提高赤霉素产量中的应用,所述CRISPR/Cpf1基因编辑系统为骨架质粒pCpf1Ff‑DR,其序列如序列表中15所示,包括Fncpf1基因、功能性crRNA基因、启动子pGPD、启动子pTRPC、强RNA聚合酶III型启动子5srRNA、潮霉素筛选标记hph;所述启动子pGPD转录Fncpf1基因,强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA,所述启动子pTRPC表达潮霉素筛选标记hph;
所述应用的具体步骤为:
(1)pCpf1Ff‑DR质粒经过SpeI酶切后,插入靶向BIK3基因的N23序列,其序列如序列表中8所示,构建质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3;
(2)pCpf1Ff‑DR‑BIK3质粒经过pmeI酶切后,插入比卡菌素基因簇的上游同源臂序列,其序列如序列表中9所示,构建质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑UP;
(3)pCpf1Ff‑DR‑BIK3‑UP质粒经过swaI酶切后,插入比卡菌素基因簇的下游同源臂序列,其序列如序列表中10所示,构建质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑HR;
(4)将pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑HR质粒转化入赤霉菌原生质体中用于大片段比卡菌素基因簇的敲除。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述启动子pGPD转录Fncpf1基因,pGPD的序列如SEQ ID NO.1所示,FnCpf1的序列如SEQ ID NO.2所示;所述强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA,5srRNA序列如SEQ ID NO.3所示,crRNA的序列如SEQ ID NO.4所示;所述启动子pTRPC转录潮霉素筛选标记hph,启动子pTRPC的序列如SEQ ID NO.5所示,潮霉素筛选标记hph的标记如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述CRISPR/Cpf1基因编辑系统的构建方法,包括如下步骤:(1)以质粒pUC‑fFuCas9‑HTBNLS‑hph为模板设计引物,扩增得到不含fFuCas9基因的骨架线性片段,将此片段骨架与Fncpf1基因经过一步克隆之后得到的重组质粒为pCpf1Ff;
(2)以重组质粒pCpf1Ff为骨架酶切得到线性化的质粒pCpf1Ff片段;
(3)以质粒pUC‑FfCas9‑HTB‑5srRNA‑FCC1为模板,设计引物,扩增得到DR基因表达盒,所述引物为5srRNA‑F和5srRNA‑DR‑R,其序列分别为GCCAGTGAATTCCACATACG和AATTAAAAAAAACTAGTCTA;
(4)将线性化的质粒pCpf1Ff和构建的DR基因表达盒克隆得到重组质粒pCpf1Ff‑DR。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(1)中引物为HTBnls‑R和HTBnls‑F,其序列分别为TCCATGGTGATGTCTGCTCA和GAGATCCTATGGCTCCCAAG。