1.一种利用酶促组装入口序列实现可视化筛选基因编辑水稻及剔除转基因成分的CRISPR/Cas9基因编辑方法,其特征在于,该方法将Cas9基因编辑元件、外源T‑DNA可视化追踪元件和转基因花粉失活元件构建到表达载体的同一个T‑DNA区中,使三者连锁遗传;
所述Cas9基因编辑元件为CRISPR/Cas9表达结构,包括Cas9基因表达框和gRNA表达框;
所述Cas9基因表达框由Ubi启动子驱动Cas9基因,由NOS终止子终止;所述gRNA表达框包括由小RNA启动子、如SEQ ID NO.15所示的间隔序列、编辑基因靶位点序列和如SEQ ID NO.8所示的guide‑RNA组成;所述小RNA启动子为OsU3、OsU6a中的一种;所述编辑基因为水稻穗颈伸长基因OsEUI1;
所述外源T‑DNA可视化追踪元件为红色荧光蛋白基因DsRed的表达框,由胚乳特异性启动子ltp驱动DsRed基因,由PINII终止子终止;
所述转基因花粉失活元件为玉米α‑淀粉酶基因ZMAA1的表达框,由花粉特异性启动子Pg47驱动ZMAA1基因,由IN2‑1终止子终止;
在外源T‑DNA可视化追踪元件和转基因花粉失活元件之间引入酶促组装入口序列cgtggatgga caatttaaat tccgttttac ctg(SEQ ID NO.16),它包含一个SwaI的平末端酶切位点,SwaI酶切后的线性化表达载体与通过同源重组导入其中的gRNA表达框两端各有一段同源序列,该gRNA表达框的5’端为gR‑ZF序列,即cgtggatgga caatttaaat tccgttttac ctgtggaatc gg(SEQ ID NO.26),3’端为gR‑ZR序列,即caggtaaaac ggaatttaat tccatccact ccaagctctt g(SEQ ID NO.26)的反向互补序列;通过同源重组将一个gRNA表达框组装到表达载体上,得到酶促组装产物一,该酶促组装产物转化至大肠杆菌感受态细胞后,筛选含有所述靶位点的基因编辑载体的转化子,转化子再与下一个gRNA表达框进行酶促组装得到酶促组装产物二,每重组一个gRNA表达框后又重新生成一个完全一样的酶促组装入口序列,可以用于下一个gRNA表达框的循环组装;
将所述酶促组装产物二导入水稻中,获得靶位点发生基因编辑水稻;从靶位点发生基因编辑水稻后代中,根据胚乳是否含有荧光,筛选无红色荧光的种子,获得剔除了转基因成分且靶位点发生基因编辑的水稻;
所述DsRed基因的DNA序列如SEQ ID NO.10所示;所述ZMAA1基因的DNA序列如SEQ ID NO.13所示;所述花粉特异性启动子Pg47的DNA序列如SEQ ID NO.12所示;所述IN2‑1终止子的DNA序列如SEQ ID NO.14所示;所述OsU3的DNA序列如SEQ ID NO.4所示;所述OsU6a的DNA序列如SEQ ID NO.5所示;所述胚乳特异性启动子ltp的DNA序列如SEQ ID NO.9所示;所述PINII终止子的DNA序列如SEQ ID NO.11所示;所述花粉特异性启动子Pg47的DNA序列如SEQ ID NO.12所示;所述IN2‑1终止子的DNA序列如SEQ ID NO.14所示,所述Ubi启动子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示;Cas9基因的DNA序列如SEQ ID NO.2所示;所述NOS终止子的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。