3

1.基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是：利用质粒pTRV2e 构3

建表达Cas12a蛋白和表达Cas12a蛋白并转录crRNA载体，并通过重组病毒TRVe在植物中表达Cas12a蛋白和转录crRNA，对靶标基因进行定点编辑。

2.根据权利要求1所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方3 3

法，其特征是：利用了重组质粒pTRV2e ，所述pTRV2e 中含有来源于TRV基因组RNA2中的2b SGP和2c SGP序列以及相应的多克隆位点1和多克隆位点2。

3.根据权利要求2所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方3 3

法，其特征是：利用pTRV2e构建表达Cas12a蛋白的载体pTRV2e‑MCS1‑Cas12a和表达Cas12a3

蛋白并转录crGFP的载体pTRV2e‑crGFP‑Cas12a。

4.根据权利要求3所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方3

法，其特征是载体pTRV2e‑crGFP‑Cas12a的构建方法为：3 3

1)、PCR扩增Cas12a基因并通过BamHⅠ/SmaⅠ克隆至质粒pTRV2e ，获得载体pTRV2e ‑MCS1‑Cas12a；

2)、通过CRISPR‑P在线软件选择GFP基因的编辑靶点，PCR扩增、双酶切将crGFP序列克3 3

隆至质粒pTRV2e‑MCS1‑Cas12a中，获得载体pTRV2e‑crGFP‑Cas12a。

5.根据权利要求4所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是：3 3 3

载体pTRV2e 、pTRV2e‑MCS1‑Cas12a和pTRV2e‑crGFP‑Cas12a农杆菌转化后，并与农杆3 3 3

菌pTRV1混和后，从而对应的形成TRVe、TRVe‑Cas12a和TRVe‑crGFP‑Cas12a这3种农杆菌混和物；浸润接种于本氏烟中，分析病毒表达Cas12a蛋白情形；

3 3 3

在TRVe 、TRVe‑Cas12a和TRVe‑crGFP‑Cas12a中分别加入35S‑p19农杆菌，从而对应的3 3

形成TRVe ‑Cas12a+35S‑p19、TRVe‑crGFP‑Cas12a+35S‑p19这3种农杆菌混和物，然后将3 3

TRVe‑Cas12a+35S‑p19、TRVe ‑crGFP‑Cas12a+35S‑p19浸润接种于本氏烟16c，观察病毒接3

种叶中的荧光表型，确定病毒TRVe‑crGFP‑Cas12a对本氏烟16c中GFP基因的编辑情形。

6.根据权利要求4或5所述基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是还包括以下步骤：3

1)提取各个病毒载体侵染叶片中总蛋白用于Western blot分析，蛋白杂交检测TRVe ‑3

Cas12a、TRVe‑crGFP‑Cas12a侵染的植物中总蛋白中GFP含量以及Cas12a表达情形；

2)提取各个病毒载体侵染叶片的基因组DNA用作模板，通过特异性引物扩增基因组中3

的外源插入GFP基因，GFP基因PCR产物用限制性内切酶NdeⅠ，确定病毒TRVe‑crGFP‑Cas12a对靶标基因GFP的定点编辑效率。

7.利用权利要求1～6任一所述方法构建所得表达Cas12a蛋白并转录crRNA载体的用3

途，其特征是：利用病毒TRVe 在表达外源蛋白速度快与含量高的特点对寄主植物的靶标基因进行定点编辑。