1.一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)暗纹东方鲀稚鱼的选取:选取健康的暗纹东方鲀,在非应激状态下饥饿24小时;
(2)细胞培养载体的预处理:使用多聚赖氨酸预处理细胞培养载体底面,细胞级无菌水清洗细胞培养载体底部,晾干细胞培养载体备用;
(3)肾组织的处理:将肾组织放置于含青霉素‑链霉素的D‑Hanks液中,清洗处理后剪碎;
(4)肾组织的消化:剪碎后的肾组织转移至含EDTA的胰蛋白酶中消化,消化后用细胞滤网过滤,用含胎牛血清的细胞培养液冲洗细胞滤网,同时终止消化,离心后弃上清,得到细胞;
(5)原代培养:向细胞中加入适量的完全培养液,用移液枪反复轻轻吹打混匀,将细胞悬液转入细胞培养载体中,置于细胞培养箱培养;
步骤(4)中,剪碎的肾组织于37℃消化,消化时间为30‑50分钟,消化期间每隔5min用无菌枪头轻轻搅拌混匀一次,消化后的肾组织成浆状,可以直接通过100µm细胞滤网;
步骤(5)中,完全培养液包括:RMPI1640基础培养液中加入胎牛血清、暗纹东方鲀血清、青霉素‑链霉素双抗。
2.根据权利要求1所述的一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法,其特征在于,步骤(1)中暗纹东方鲀稚鱼的体长为15±3cm,体重为100±20g。
3.根据权利要求1所述的一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法,其特征在于,步骤(2)中细胞培养载体的预处理具体包括以下步骤:多聚赖氨酸(Poly‑D‑lysine)用细胞培养级无菌水稀释为0.1mg/ml的浓度,浸润细胞培养载体底面30分钟后,用细胞培养级无菌水清洗,细胞培养载体底面仅留存一层极薄的多聚赖氨酸,无菌环境中12小时自然晾干备用。
4.根据权利要求1所述的一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法,其特征在于,步骤(3)中,清洗处理时,需要仔细剔除肾动脉、肾静脉以及肾脏表膜并尽可能清洗组织中残余血液。
5.根据权利要求1所述的一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法,其特征在于,步骤(4)中含EDTA胰蛋白酶的浓度为0.25%(w/v)。
6.根据权利要求1所述的一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法,其特征在于,步骤(5)中,完全培养液中,胎牛血清所占比例为15‑20%(v/v),暗纹东方鲀血清所占比例为1‑5%(v/v),青霉素‑链霉素双抗溶液所占比例为1‑3%(v/v)。