1.一种高产D‑泛酸的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌是以E.coliW3110Trc‑a b c

panCpanEpanBilvC/ilvG/ΔavtA/ilvE/coaAΔilvATrc‑lpdΔglk为出发菌株，回补ilvA基因，将ilvE的起始密码子GTG突变成TTG，再分别将serA、glyA、ilvB、ilvN、pntA、pntB、cyo基因的 启动子替换为Trc启动子 ，最后过表达来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13032的基因panB和基因panC构建而成；a表示ilvG基因的976‑979碱基突变成ATC；b表示ilvE基因的起始密码子ATG突变成GTG；c表示coaA基因的316‑318位碱CGT基突变成GCT。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述ilvA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述ilvE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述serA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述glyA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述ilvB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述ilvN基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述pntA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述pntB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述cyo基因基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述panB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述panC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。所述Trc启动子基因核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌按如下方法构建：a

(1)回补ilvA基因：以出发菌株E.coli W3110 Trc‑panCpanEpanBilvC/ilvG /ΔavtA/b c

ilvE/coaAΔilvATrc‑lpdΔglk)为模板，分别以L‑ilvA‑F/L‑ilvA‑R和R‑ilvA‑F/R‑ilvA‑R为引物，扩增基因供体donor DNA；以E.coli W3110的基因组为模板，以T‑ilvA‑F和T‑ilvA‑R引物扩增得到ilvA片段；以pTarget质粒为模板，以pTarget‑ilvA‑F和pTarget‑ilvA‑R为引物扩增质粒并线性化处理得到线性化pTarget‑ilvA质粒；将donor DNA、ilvA片段和线性化pTarget‑ilvA质粒连接后转化出发菌株电转感受态细胞，消除pTarget和pCas9*

质粒，构建菌株DPA11(ilvA)，记为菌株DPA12；所述出发菌株记为菌株DPA11；

(2)ilvE的起始密码子突变：以pTarget质粒为模板，以pTarget‑ilvE‑F和pTarget‑ilvE‑R为引物扩增质粒并线性化处理得到线性化质粒pTarget‑ilvE；以出发菌株基因组为模板，以引入突变的起始密码子TGG的L‑ilvE‑F/L‑ilvE‑R和R‑ilvE‑F/R‑ilvE‑R为引物扩增得到上下游donor DNA；将线性化质粒pTarget‑ilvE与上下游donor DNA连接，利用引物T‑ilvE‑F/T‑ilvE‑R测序成功后转化菌株DPA12电转感受态细胞，消除pTarget和pCas9质* **

粒，构建菌株DPA11(ilvAilvE )，记为菌株DPA13；

(3)serA启动子替换：以pTarget作为模板，以pTarget‑serA‑F和pTarget‑serA‑R为引物扩增质粒并线性化处理，获得线性化质粒pTarget‑serA；以出发菌株基因组为模板，以L‑serA‑F/L‑serA‑R和R‑serA‑F/R‑serA‑R为引物扩增得到上下游donor DNA；将线性化质粒pTarget‑serA与上下游donor DNA连接，通过引物T‑serA‑F/T‑serA‑R测序成功后转化菌株* **

DPA13电转感受态细胞并消除质粒pTarget和pCas9，构建菌株DPA11(ilvA ilvE Trc‑serA)，记为菌株DPA14；

(4)glyA启动子替换：以pTarget作为模板，以pTarget‑glyA‑F和pTarget‑glyA‑R为引物扩增质粒并进行线性化处理获得线性化质粒pTarget‑glyA；以出发菌株基因组为模板，以L‑glyA‑F/L‑glyA‑R和R‑glyA‑F/R‑glyA‑R为引物扩增得到上下游donor DNA；将线性化质粒pTarget‑glyA和上下游donor DNA连接，通过引物T‑glyA‑F/T‑glyA‑R测序成功后转化* **

菌株DPA14电转感受态细胞并消除质粒pTarget和pCas9，构建菌株DPA11(ilvAilvE Trc‑serATrc‑glyA)，记为菌株DPA15；

(5)ilvB、ilvN的启动子替换：以pTarget作为模板，以pTarget‑ilvBN‑F和pTarget‑ilvBN‑R为引物扩增质粒并进行线性化处理获得线性化质粒pTarget‑ilvBN；以出发菌株基因组为模板，以L‑ilvBN‑F/L‑ilvBN‑R和R‑ilvBN‑F/R‑ilvBN‑R为引物扩增得到上下游donor DNA；将线性化质粒pTarget‑ilvBN和上下游donor DNA连接，通过引物T‑glyA‑F/T‑glyA‑R测序成功后转化菌株DPA15电转感受态细胞并消除质粒pTarget和pCas9，构建菌株* **

DPA11(ilvAilvE Trc‑serATrc‑glyATrc‑ilvBN)，记为菌株DPA16；

(6)pntA、pntB的启动子替换：以pTarget作为模板，以pTarget‑pntAB‑F和pTarget‑pntAB‑R为引物扩增质粒并进行线性化处理获得线性化质粒pTarget‑pntAB；以出发菌株基因组为模板，以L‑pntAB‑F/L‑pntAB‑R和R‑pntAB‑F/R‑pntAB‑R为引物扩增得到上下游donor DNA；将线性化质粒pTarget‑pntAB与上下游donor DNA连接，通过引物T‑pntAB‑F/T‑pntAB‑R测序成功后转化菌株DPA16电转感受态细胞并消除质粒pTarget和pCas9，构建菌株* *

DPA11(ilvAilvETrc‑serATrc‑glyATrc‑ilvBNTrc‑pntAB)，记为菌株DPA17；

(7)cyo启动子的替换：以pTarget作为模板，以pTarget‑cyo‑F和pTarget‑cyo‑R为引物扩增并进行线性化处理获得线性化质粒pTarget‑cyo；以出发菌株基因组为模板，以L‑cyo‑F/L‑cyo‑R和R‑cyo‑F/R‑cyo‑R为引物扩增得到上下游donor DNA；将线性化质粒pTarget‑cyo与上下游donor DNA连接，通过引物T‑cyo‑F/T‑cyo‑R测序成功后转化菌株DPA17电转感* *

受态细胞并消除质粒pTarget和pCas9，构建菌株DPA11(ilvAilvE Trc‑serATrc‑glyATrc‑ilvBNTrc‑pntABTrc‑cyo)，记为菌株DPA18；

(8)过表达来源于谷氨酸棒状杆菌的panB和panC：以质粒pTrc99a为模板，以pTrc99a‑line‑F/pTrc99a‑line‑R为引物进行PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化2h，去除其中的 甲基化 载体 ，获得 线性化 pTr c99 a质粒 ；以谷 氨酸 棒状杆 菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13032的基因组为模板，以引物panB‑F/panB‑R和panC‑F/panC‑R，分别PCR扩增panB和panC片段；将线性化pTrc99a质粒、片段panB和panC连接转化E.coliDH5α感受态，提取质粒pBC；将pBC质粒转化到菌株DPA18中，构建菌株DPA11* *

(ilvAilvETrc‑serATrc‑glyATrc‑ilvBNTrc‑pntABTrc‑cyo)/pBC，即为所述的高产D‑泛酸的基因工程菌，记为菌株DPA19。

4.一种权利要求1所述基因工程菌在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种到含有50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，25‑32℃、180‑200rpm条件下发酵培养OD600＝0.4‑0.6时，添加终浓度为0.2mM的IPTG，继续发酵培养至48h，发酵结束后，获得D‑泛酸的发酵液，分离纯化，获得D‑泛酸；所述发酵培养基组成：葡萄糖20g/L、酵母提取物3g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4 0.5g/L、碳酸钙15g/L、β‑丙氨酸2.5g/L、1mL微量元素溶液，用自来水溶解，pH值为自然值；微量元素溶液组成为：10g/L CaCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.2g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵在发酵罐中采用补料发酵培养：将所述基因工程菌接种至含有50mg/L卡那霉素抗性LB试管培养基中，37℃培养10h作为种子液；

按体积浓度5％接种量接种至LB培养基中，37℃培养12h，作为上罐的种子液；将上罐种子液按体积浓度15％接种至装有发酵培养基的发酵罐中，在30℃、500rpm、通气量为0.5V/V·min条件下发酵培养，当发酵液中的溶氧量瞬间大幅度提高时，打开自动补料程序，补料方式采用pH联动，当发酵液中的pH值高于6.80时自动补料，当发酵液中pH值低于6.80时停止补料，保持发酵液中的糖浓度维持在2‑4g/L，继续发酵培养92h，获得含D‑泛酸的发酵液；所述补料培养基：葡萄糖500g/L，酵母提取物3g/L，(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 14g/L、MgSO4 8g/L，β‑丙氨酸30g/L，利用去离子水溶解，用50％的氨水调节pH为6.8。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述补料培养基总添加量为500mL/2L发酵培养基，补料速度为25mL/h。