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专利号: 2021107275768
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种高产D‑泛酸的基因工程菌,其特征在于,通过以下步骤构建获得:(1)以保藏号为CCTCC NO:M2018914的大肠杆菌为出发菌株,敲除aceF和mdh两个基因,获得菌株DPA02;

(2)将来源于谷氨酸棒状杆菌的panB与panC基因,以及ppnk基因在菌株DPA02中过表达获得高产D‑泛酸的基因工程菌,aceF基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;mdh基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;

panB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;panC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述ppnk基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,步骤(2)中将panB基因、panC基因以及ppnk基因同时克隆到pTrc99A质粒中,获得质粒pTrc99A‑panBC‑ppnk,将该质粒转入菌株DPA02中进行独立过表达,获得高产D‑泛酸的基因工程菌。

2.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,敲除aceF和mdh两个基因时使用CRISPR‑Cas9基因编辑技术。

3.如权利要求1或2所述基因工程菌在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,发酵过程中控制发酵体系pH维持在6.6 6.8,~温度维持在28 30℃。

~

5.如权利要求3所述的应用,其特征在于,在发酵延迟期添加2 g/L的甜菜碱,缓解发酵系统中所述基因工程菌对渗透压的敏感。

6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,发酵起始时使用发酵培养基,并依据20%溶氧反馈补料策略,将补料培养基补加至发酵系统,所述发酵培养基组成如下:葡萄糖10~20 g/L、(NH4)2SO4 12~16 g/L、KH2PO4 1~2 g/L、MgSO4 0.3~0.5 g/L、酵母提取物1~2 g/L、0.5~1 ml/L微量元素溶液,50~75 mg/L Kan抗生素,0.1 0.2 mM的IPTG,溶剂为去离子水,pH值自然;微量元素溶液组成为:5 10 g/L ~ ~CoCl2、5~10 g/L FeSO4·7H2O、0.5~1 g/L ZnSO4·7H2O、0.10~0.20 g/L CuSO4、0.01~0.02 g/L NiCl2·7H2O,溶剂为去离子水;

补料培养基:葡萄糖400 500 g/L,酵母提取物 1 2g/L,硫酸铵8 10 g/L,硫酸镁6 8 ~ ~ ~ ~g/L,磷酸二氢钾10~14 g/L,β‑丙氨酸35~40 g/L,异亮氨酸0.1~0.16 g/L,VB1 8~10 mg/L,VB12 2~4 mg/L,Kan抗生素 50~75 mg/L,IPTG 72~96 mg/L,金属盐溶液1~2 mL/L,消泡剂1~

2 mL/L。