1.一种在赤霉菌中建立的基于CRISPR技术整合的URA‑Blaster方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)以URA3基因缺失的赤霉菌作为出发菌,利用Crispr技术将筛选标记HisG‑URA3‑HisG片段整合到所述出发菌的基因组上,得到阳性转化菌;所述Crispr技术将筛选标记HisG‑URA3‑HisG片段整合到所述出发菌的基因组上的过程包括:将含有所述HisG‑URA3‑HisG片段的pUC‑FfHUH‑5sFCC1‑HR质粒转化至感受态的所述出发菌中,同时敲除FCC1基因片段;
所述pUC‑FfHUH‑5sFCC1‑HR质粒的制备方法包括:
S1、将pUC‑HUH质粒使用KpnI以及BamHI进行双酶切,以切除URA3片段,得到酶切后的pUC‑HUH质粒;以赤霉菌基因组为模板,设计引物TRPC‑F和TRPC‑R扩增出启动子TRPC,设计引物FFura3‑F和FFura3‑R扩增出URA3以及终止子序列,分别纯化后与所述酶切后的pUC‑HUH质粒进行克隆,得到pUC‑FfHUH质粒;
S2、将所述pUC‑FfHUH质粒使用内切酶HindIII 进行酶切,得到线性化的pUC‑FfHUH质粒片段;以赤霉菌基因组为模板,设计引物FCC1‑DN‑F和FCC1‑DN‑R扩增出FCC1的下游同源臂FCC1‑DN,然后与所述线性化的pUC‑FfHUH质粒片段进行克隆,得到pUC‑FfHUH‑FCC1‑DN质粒;
S3、将所述pUC‑FfHUH‑FCC1‑DN质粒使用内切酶EcoRI进行酶切,得到线性化的pUC‑FfHUH‑FCC1‑DN质粒片段;以赤霉菌基因组为模板,设计引物FCC1‑UP‑F和FCC1‑UP‑R扩增出FCC1的上游同源臂FCC1‑UP,然后与所述线性化的pUC‑FfHUH‑FCC1‑DN质粒片段进行克隆,得到pUC‑FfHUH‑FCC1‑HR质粒;
S4、将所述pUC‑FfHUH‑FCC1‑HR质粒使用内切酶EcoRI进行酶切,得到线性化的pUC‑FfHUH‑FCC1‑HR质粒片段;以pUC‑Ffcas9‑HTB‑5srRNA‑FCC1质粒为模板,设计引物5s‑FCC1‑F和5s‑FCC1‑R扩增出片段5s‑FCC1,然后与所述线性化的pUC‑FfHUH‑FCC1‑HR质粒片段进行克隆,得到pUC‑FfHUH‑5sFCC1‑HR质粒;
步骤S1中所述URA3片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示,所述TRPC‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,所述TRPC‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,所述TRPC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,所述FFura3‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,所述FFura3‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示,所述URA3以及终止子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示;
步骤S2中所述FCC1‑DN‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示,所述FCC1‑DN‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,所述FCC1‑DN的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示;
步骤S3中所述FCC1‑UP‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示,所述FCC1‑UP‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示,所述FCC1‑UP的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示;
步骤S4中所述5s‑FCC1‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示,所述5s‑FCC1‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示,所述5s‑FCC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示;
(2)将所述阳性转化菌的基因组上URA3基因丟除,以能够再次作为出发菌循环利用URA3筛选标记进行遗传转化;所述将阳性转化菌的基因组上URA3基因丟除的过程包括:将所述阳性转化菌在含有5‑氟乳清酸的培养基中进行培养反筛得到反筛菌株,在所述反筛菌株中筛选出不能在基础培养基中生长的菌株;
其中,所述HisG‑URA3‑HisG片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所示URA3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述URA3基因缺失的赤霉菌的制备方法包括以下步骤:构建URA3敲除质粒,将所述URA3敲除质粒转化至感受态的赤霉菌中得到转化子I,然后在所述转化子I中挑选出URA3基因成功敲除的菌株。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述URA3敲除质粒为FfCas9‑URA3‑HR质粒;
所述FfCas9‑URA3‑HR质粒的制备过程包括:以FfCas9‑URA3质粒为骨架质粒,将所述FfCas9‑URA3质粒先用StuI酶切后插入URA的上游同源臂URA3‑UP得到FfCas9‑URA3‑UP,再用SwaI酶切后插入URA的下游同源臂URA3‑DN得到FfCas9‑URA3‑HR;
其中,所述URA3‑UP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述URA3‑DN的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述FfCas9‑URA3质粒的制备过程包括:将pUC‑fFuCas9‑HTBNLS‑hph质粒用内切酶EcoRI酶切后形成pUC‑fFuCas9‑HTBNLS‑hph线性片段,以FfCas9‑URA3‑PPT1质粒为模板,设计引物5sURA3‑F和5sURA3‑R,进行PCR扩增,得到
5sURA3‑N20‑gRNA线性片段,将所述5sURA3‑N20‑gRNA线性片段与所述pUC‑fFuCas9‑HTBNLS‑hph线性片段进行克隆;
其中,所述5sURA3‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述5sURA3‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述5sURA3‑N20‑gRNA线性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述挑选出URA3基因成功敲除的菌株的过程包括:将所述转化子I培养后提取得到转化子I基因组,以所述转化子I基因组为模板设计两对引物URA3‑YZ‑F和cas9‑YZ‑R,URA3‑YZ‑R和cas9‑YZ‑F,然后进行PCR扩增,所述两对引物均能够扩增出大小正确的条带即为URA3基因成功敲除的菌株;
其中,所述URA3‑YZ‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示,所述URA3‑YZ‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示,所述cas9‑YZ‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示,所述cas9‑YZ‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述含有5‑氟乳清酸的培养基为含有5‑氟乳清酸的YPD固体培养基,所述5‑氟乳清酸的含量为1‑3g/L,所述基础培养基含有葡萄糖
15‑25g/L,蔗糖200‑250g/L,无氨基酸酵母氮源1‑2.5g/L,硫酸铵4‑6g/L,琼脂粉20‑30g/L;
所述培养反筛的条件包括:温度为20‑40℃,时间为48‑72h。