3

1.同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e的构建方法，其特征是：以TRV基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，采用病毒基因缺失策略构建包含TRV的2b和2c基因启3

动子载体pTRV2e；具体为：1 1

利用重组质粒pTRV2e，在pTRV2e 插入TRV的2c基因亚基因组启动子序列和多克隆位点3

2，获得含有多克隆位点MCS1和MCS2的载体pTRV2e；

3

pTRV2e中基因组RNA2如SEQ ID NO:3所示；

1

pTRV2e是以质粒pYL156为模板制备而得：以TRV基因组RNA2的T‑DNA侵染性克隆pYL1561

为载体，构建缺失TRV的2b基因并含有多克隆位点1的重组质粒pTRV2e；

TRV的2c基因启动子序列为：Tagaatcggtccaatcgtttacggttggttattgtgattggttgatgaggaaattctgtttgaaggctggttgaaagtaccagggcgggaga agccatattctctatcgttgtaggaagcgattgaaataattcctgtggtcacgtcgcacgtgaggtggttgttaccataaacaataatgtcgttggca gcatttaaaataattccatagttactaagagggtgattgtgaccaaaggagcg。

3 3

2.利用如权利要求1所述的pTRV2e 制备能同时表达GFP和RFP的病毒TRVe‑rfp‑gfp的方法，其特征是包括以下步骤：3 3

1)、PCR扩增绿色蛋白基因并通过双酶切连接至质粒pTRV2e ，获得载体pTRV2e‑gfp‑MCS2；

3 3

2)、以pTRV2e ‑gfp‑MCS2为模板，PCR扩增、双酶切克隆至质粒pTRV2e 中，获得载体3

pTRV2e‑MCS1‑gfp；

3

3)、PCR扩增红色蛋白基因并通过双酶切克隆至pTRV2e ‑MCS1‑gfp，获得到载体3 3

pTRV2e‑rfp‑gfp；载体pTRVe‑rfp‑gfp农杆菌转化后，并与农杆菌pTRV1混和后浸润接种于3

本氏烟中，病毒TRVe‑rfp‑gfp在浸润接种叶片中产生表达GFP和RFP。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是还包括以下步骤：3

提取病毒TRVe‑rfp‑gfp侵染植株系统叶中总蛋白用于Western blot分析，蛋白杂交能3

在TRVe‑rfp‑gfp侵染的本氏烟总蛋白能特异性检测到GFP和RFP。

1 3

4.如权利要求1所述方法构建所得外源蛋白表达载体pTRV2e 和pTRV2e的用途，其特征1 3 3

是：病毒TRVe 和TRVe 在寄主植物中引起轻微的症状反应，携带2个外源基因的病毒TRVe ‑rfp‑gfp在整个植株同时表达GFP和RFP；

1 1 3 3

所述TRVe由pTRV1和pTRV2e组成，所述TRVe由pTRV1和pTRV2e组成。