CP

1.同时表达3个非融合外源蛋白病毒载体TRVeΔ 的构建法，其特征是：以同时表达2个3

非融合外源蛋白的载体pTRV2e 为材料，采用基因缺失策略构建包含TRV的CP、2b和2c亚基CP因组启动子载体pTRV2eΔ 。

3

2.根据权利要求1所述的构建方法，利用质粒pTRV2e，其特征是：3

在载体pTRV2e中缺失TRV基因组RNA中CP基因ORF序列和插入多克隆位点，获得含有多CP克隆位点MCS1、MCS2和MCS3的载体pTRV2eΔ 。

CP

3.利用如权利要求1或2所述的载体pTRV2eΔ 制备能同时表达烟草花叶病毒(TMV)CPCP蛋白、拟南芥三磷酸甘油醛脱氢酶GapC和GFP的病毒TRVeΔ ‑CP‑GapC‑GFP的方法，其特征是包括以下步骤：1)、PCR扩增通过3对含不同酶切位点的引物，PCR扩增GFP，PCR产物经不同的双酶切后CP CP CP分别克隆载体pTRV2eΔ 中，获得pTRV2eΔ ‑GFP‑MCS2‑MCS3、pTRV2eΔ ‑MCS1‑GFP‑MCS3CP和pTRV2eΔ ‑MCS1‑MCS2‑GFP；

CP CP

2)、PCR扩增TMV的CP的ORF，双酶切连接至至质粒pTRV2eΔ 中，获得pTRV2eΔ ‑CP‑MCS2‑MCS3；

CP

3)、PCR扩增拟南芥三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GapC)、双酶切克隆至质粒pTRV2eΔ 中，CP获得载体pTRV2eΔ ‑MCS1‑GapC‑MCS3；

CP

4)、将步骤2)所得经双酶切CP的PCR产物克隆至步骤1)所得的载体pTRV2eΔ ‑MCS1‑CPMCS2‑GFP中，获得pTRV2eΔ ‑CP‑MCS2‑GFP；

CP

将步骤3)所得经双酶切GapC的PCR产物克隆至载体pTRV2eΔ ‑CP‑MCS2‑GFP，得到载体CPpTRV2eΔ ‑CP‑GapC‑GFP；

CP

5)、将步骤4)所得的pTRV2eΔ ‑CP‑GapC‑GFP转化至农杆菌GV3101中，并与农杆菌CPpTRV1混和后获得病毒TRVeΔ ‑CP‑GapC‑GFP。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是还包括以下步骤：CP

提取TRVeΔ ‑CP‑GapC‑GFP侵染植株系统叶中总蛋白用于Western blot分析，在病毒侵染的番茄中能特异性同时检测到CP、GapC和GFP。

CP

5.如权利要求1所述方法构建所得的外源蛋白病毒载体TRVeΔ 的用途，其特征是：CP CP

TRVeΔ 在寄主植物中引起轻花叶的症状反应，携带3个外源基因的TRVeΔ ‑CP‑RFP‑GFP在整个植株同时表达CP、GapC和GFP。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征是：CP CP

所述TRVeΔ 由pTRV1和pTRV2eΔ 组成；

CP CP

所述TRVeΔ ‑GFP‑MCS2‑MCS3由pTRV1和pTRV2eΔ ‑GFP‑MCS2‑MCS3组成；

CP CP

所述TRVeΔ ‑MCS1‑GFP‑MCS3由pTRV1和pTRV2eΔ ‑MCS1‑GFP‑MCS3组成；

CP CP

所述TRVeΔ ‑MCS1‑MCS2‑GFP由pTRV1和pTRV2eΔ ‑MCS1‑MCS2‑GFP组成；

CP CP CP

所述TRVeΔ ‑CP‑MCS2‑MCS3由pTRV1和pTRV2eΔ ‑CP‑MCS2‑MCS3组成；所述TRVeΔ ‑CPMCS1‑GapC‑MCS3由pTRV1和pTRV2eΔ ‑MCS1‑GapC‑MCS3组成；

CP CP

所述TRVeΔ ‑CP‑GapC‑GFP由pTRV1和pTRV2eΔ ‑CP‑GapC‑GFP组成。