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专利号: 202110559185X
申请人: 辽宁大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-30
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌,其特征在于,所述纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌为komagataella phaffii LNF013,于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCC NO.22081。

2.一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌的构建方法,其特征在于,方法包括如下步骤:

1)GAP启动子基因片段的获得:以pGAPZα‑A质粒为模板,以Primer5和Primer6为引物,通过PCR反应,获得两端添加酶切位点Kpn I和Not I的GAP启动子基因片段;

Primer5:GGGGTACCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCPrimer6:ATAAGAATGCGGCCGCATAGTTGTTCAATTGATTGAA

2)pGAPZα‑A‑NKt2载体质粒的获得:以pGAPZα‑A‑NKt2为模板,以Primer7和Primer8为引物,通过环PCR扩增,获得在pGAPZα‑A‑NKt2下游两端添加酶切位点Kpn I和Not I的pGAPZα‑A‑NKt2载体质粒;

Primer7:ATAAGAATGCGGCCGCTTCGAAACGATGAGATTTCCTPrimer8:GGGGTACCATAGTTGTTCAATTGATTGAA

3)构建pGAPZα‑A‑GAP‑GAP‑NKt2重组表达载体:将步骤1)获得的两端添加酶切位点Kpn I和Not I的GAP启动子基因片段和步骤2)获得的在pGAPZα‑A‑NKt2下游两端添加酶切位点Kpn I和Not I的pGAPZα‑A‑NKt2载体质粒,通过双酶切连接,获得pGAPZα‑A‑GAP‑GAP‑NKt2重组表达载体;

4)转化:将pGAPZα‑A‑GAP‑GAP‑NKt2重组表达载体转化到毕赤酵母X33中,获得重组基因工程菌komagataella phaffii LNF013。

3.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,步骤1)中,PCR反应的条件为:PCR反应体系:Primer 5 2μl,Primer 6 2μl,2×Es taq Master Mix 25μl,pGAPZα‑A质粒DNA 1μl,ddH2O补至总体系50μL;

PCR反应条件:94℃预变性2min;94℃30s;55℃30s;72℃30s;25cycles;72℃延伸7min;

4℃10min。

4.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,步骤2)中,环PCR扩增的条件为:PCR反应体系:Primer 7 2μl,Primer 8 2μl,2×Es taq Master Mix 25μl,pGAPZα‑A‑NKt2 DNA 1μl,ddH2O补至总体系50μL;

PCR反应条件:98℃预变性3min;98℃30s;56℃30s;72℃50s;25cycles;72℃延伸7min;

4℃10min。

5.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,步骤4)中,将pGAPZα‑A‑GAP‑GAP‑NKt2重组表达载体,先进行线性化后,再使用电转化法转化到毕赤酵母X33中。

6.根据权利要求5所述的构建方法,其特征在于,线性化体系为:pGAPZα‑A‑GAP‑GAP‑NKt2 1μg,10×QuickCut Buffer 2μL,QuickCut Enzyme BglⅡ1μL,ddH2O补至总体系20μL;反应条件为温度37℃,酶切时间为10min‑15min。

7.权利要求1所述的一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌在表达纳豆激酶中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,方法如下:筛选纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌的阳性菌落,接种于含Zeocin的BMGY培养基中,在温度28℃,摇床转速220rmp/min下摇床培养,每培养24h向培养基中加入相对于培养基体积1%的甲醇溶液。培养4d后,冷冻离心收集蛋白上清液,为纳豆激酶蛋白RNKT2。

9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述纳豆激酶蛋白RNKT2氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。