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专利号: 2015104893804
申请人: 西南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因,命名为DrDes基因,其特征在于:核苷酸序列如SEQ ID No.1。

2.由权利要求1所述的DrDes基因指导编码的蛋白质,其特征在于:氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.包含核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体或基因表达盒或转基因细胞系或重组菌株。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体,其特征在于:表达框的启动子是BmNPV极早期启动子IE1或家蚕脂肪体组织特异性启动子Lp3。

5.根据权利要求3所述的重组表达载体,其特征在于:

是以眼和神经特异的启动子3×P3启动的红色荧光蛋白DsRed作为表达盒,红色荧光蛋白作为筛选标记,筛选标记后带有以IE1启动子启动优化后的DrDes基因;或者,是以加强型绿色荧光蛋白EGFP作为表达盒,加强型绿色荧光蛋白作为筛选标记,筛选标记后含有以Lp3启动子启动优化后的DrDes基因。

6.构建权利要求4所述的重组表达载体的方法,其特征在于:

是将权利要求1所述DrDes基因插入到出发载体pSL1180的多克隆位点得到中间载体,然后再将完整的含有DrDes基因的表达盒IE1-DrDes-SV40插入到最终载体pBac[3×P3-DsRed]得到重组表达载体;或者,是将权利要求1所述DrDes基因插入到出发载体pSL1180的多克隆位点得到中间载体,然后再将完整的含有DrDes基因的表达盒Lp3-DrDes-SV40插入到最终载体pBac[3×P3-EGFP]得到重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的构建方法,其特征在于:以如下方案之一实施:

方案一:

将DrDes基因连接于pUC57载体质粒;通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切pUC57载体质粒,回收得到DrDes基因片段,将回收片段连接进相同酶切的pSL1180[Ser1-pGH-SV40]载体,得到pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]载体;

PCR体外扩增,从BmNPV基因组中扩增IE1启动子序列,并在扩增片段上下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点,经T-A克隆进同样酶切处理的pMD19-T载体获得质粒;通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切所获得质粒,回收IE1启动子序列;

通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]载体,回收载体骨架,并与IE1启动子序列连接获得中间载体pSL1180[IE1-DrDes-SV40];

通过AscⅠ单酶切pSL1180[IE1-DrDes-SV40],按试剂盒要求回收并补平黏性末端,制得表达盒片段IE1-DrDes-SV40;

通过BglⅡ单酶切载体pBac[3×p3-DsRed],按试剂盒要求回收载体骨架并补平去磷酸化,得到pBac[3×p3-DsRed]载体骨架;

将表达盒片段IE1-DrDes-SV40与pBac[3×p3-DsRed]载体骨架连接获得最终载体pBac[3×p3-DsRed+IE1-DrDes-SV40];

方案二:

将DrDes基因连接于pUC57载体质粒;通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切pUC57载体质粒,回收得到DrDes基因片段,将回收片段连接进相同酶切的pSL1180[Ser1-pGH-SV40]载体,得到pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]载体;

PCR体外扩增,从BmNPV基因组中扩增Lp3启动子序列,并在扩增片段上下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点,经T-A克隆进pMD19-T载体获得质粒;通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切所获得质粒,回收Lp3启动子序列;

通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]载体,回收载体骨架,与Lp3启动子序列连接获得中间载体pSL1180[Lp3-DrDes-SV40];

通过AscⅠ单酶切pSL1180[Lp3-DrDes-SV40],按试剂盒要求回收并补平黏性末端,制得表达盒片段Lp3-DrDes-SV40;

通过BglⅡ单酶切pBac[3×p3-EGFP],按试剂盒要求回收载体骨架并补平去磷酸化,得到pBac[3×p3-EGFP]载体骨架;

将表达盒片段Lp3-DrDes-SV40与pBac[3×p3-EGFP]载体骨架连接获得最终载体pBac[3×p3-EGFP+Lp3-DrDes-Sv40]。

8.权利要求4所述的重组表达载体在获得高亚油酸或α-亚麻酸含量家蚕转基因品系中的应用。

9.提高家蚕组织中亚油酸或α-亚麻酸含量的方法,其特征在于:将权利要求1所述的DrDes基因导入家蚕胚胎中,经筛选,得到目标家蚕转基因系。

10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:利用piggyBac重组表达载体将所述DrDes基因整合入家蚕基因组,所述piggyBac重组表达载体是将含有所述DrDes基因的表达盒插入到出发载体pBac[3×P3-DsRed]或pBac[3×P3-EGFP]的BglⅡ酶切位点得到的载体。