1.一株分泌恶霜灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株AAB2,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,分类命名为单克隆细胞株,保藏日期2020年4月23日,保藏编号CGMCC No.19677。
2.恶霜灵单克隆抗体,其特征在于:其由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.19677的杂交瘤细胞株AAB2分泌产生。
3.恶霜灵半抗原的制备方法,其特征在于其合成路线如下所示:步骤如下:
(1)低温下,向2,6‑二甲基苯肼盐酸盐的水溶液中加入吡啶和碳氯化氯2‑氯乙基酯,将反应混合物在室温搅拌;混合物用乙酸乙酯萃取,有机层用水和盐水洗涤,经Na2SO4干燥并浓缩,得到灰白色的固体化合物2;
(2)向化合物2的THF溶液中加入4‑(2‑氯‑2‑氧代乙氧基)丁酸苄酯和三乙醇胺TEA,搅拌;将混合物用饱和NH4Cl洗涤并用乙酸乙酯EA萃取;浓缩混合物,并通过TLC纯化,得到黄色油状化合物3;
(3)向NaH在甲苯中的悬浮液中分批加入化合物3,将混合物在室温搅拌;通过TLC纯化混合物,得到无色油状化合物4;
(4)向化合物4的MeOH溶液中加入钯碳催化剂Pd‑C;将混合物在室温搅拌,然后将混合物过滤;将滤液浓缩并通过制备型TLC纯化,得到呈黄色凝胶状的目标化合物,即为恶霜灵的半抗原。
4.根据权利要求3所述恶霜灵半抗原的制备方法,其特征在于具体步骤如下:(1)在0‑5℃下,向29.1mmol的2,6‑二甲基苯肼盐酸盐的水溶液中加入吡啶87.2mmol和碳氯化氯2‑氯乙基酯29.1mmol,将反应混合物在室温搅拌2h;混合物用乙酸乙酯萃取,有机层用水和盐水洗涤,经Na2SO4干燥并浓缩,得到灰白色的固体化合物2;
(2)向9.1mmol化合物2的40mL THF溶液中加入4‑(2‑氯‑2‑氧代乙氧基)丁酸苄酯
9.1mmol和三乙醇胺TEA 27.3mmol;将反应混合物在65℃下搅拌2h;将混合物用饱和NH4Cl洗涤并用乙酸乙酯EA萃取;浓缩混合物,并通过TLC纯化,得到黄色油状化合物3;
(3)向2.1mmol NaH在450mL甲苯中的悬浮液中分批加入2.1mmol化合物3;将混合物在室温搅拌15min;通过TLC纯化混合物,得到无色油状化合物4;
(4)向1.8mmol化合物4的40mL MeOH溶液中加入钯碳催化剂Pd‑C 120mg;将混合物在室温搅拌1h,然后将混合物过滤,将滤液浓缩并通过TLC纯化,得到呈黄色凝胶状的目标化合物,即为恶霜灵的半抗原。
5.根据权利要求4所述恶霜灵半抗原的制备方法,其特征在于4‑(2‑氯‑2‑氧代乙氧基)丁酸苄酯的制备过程如下:制备路线为:
(1)在化合物5,2‑(4‑羟基丁氧基)乙酸叔丁酯的DCM溶液中分批加入Dess‑Martin高碘烷,向混合物添加Na2S2O3和NaHCO3的溶液,再用DCM萃取,浓缩有机层,并通过色谱法纯化,得到化合物6;
(2)将NaClO2水溶液添加到一水合NaH2PO4的水溶液中;将水溶液加入到2‑甲基丁‑2‑烯和化合物6的叔丁醇中的预冷溶液中;将混合物在低温下搅拌,向混合物中加入水,并用EA萃取;混合物经Na2SO4干燥并浓缩,得到化合物7;
(3)向化合物7的DMF溶液中加入溴甲基苯和K2CO3;将混合物在室温搅拌1h然后加入水,并用乙酸乙酯萃取;有机层用水和盐水洗涤,经Na2SO4干燥,浓缩并通过色谱法纯化,得到化合物8;
(4)向化合物8的DCM溶液中加入TFA,将混合物在室温搅拌1h;将混合物浓缩并加入水;
将混合物用DCM萃取,有机层经Na2SO4干燥并浓缩,得到化合物9;
(5)在低温下,向化合物9的DCM溶液中滴加(COCl)2,将混合物在室温搅拌1h;浓缩混合物,得到4‑(2‑氯‑2‑氧代乙氧基)丁酸苄酯。
6.恶霜灵完全抗原的制备方法,其特征在于:包括恶霜灵免疫原和恶霜灵包被原;
免疫原的制备方法为:取恶霜灵半抗原,再加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N‑羟基琥珀酰亚胺NHS,使用N,N‑二甲基甲酰胺DMF溶解,室温搅拌活化,得到活化液;另取牛血清蛋白BSA溶解于碳酸盐缓冲溶液CB中;将活化液逐滴加入BSA溶液中,室温搅拌反应过夜后,采用PBS缓冲液透析分装保存,得到恶霜灵免疫原;
包被原的制备方法为:取恶霜灵半抗原,再加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N‑羟基琥珀酰亚胺NHS,使用N,N‑二甲基甲酰胺DMF溶解,室温搅拌活化,得到活化液;另取鸡卵白蛋白OVA溶解于碳酸盐缓冲溶液CB中;将活化液逐滴加入OVA溶液中,室温搅拌反应过夜后,采用PBS缓冲液透析分装保存,得到恶霜灵包被原。
7.根据权利要求6所述恶霜灵完全抗原的制备方法,其特征在于免疫原的制备,步骤如下:取4.5mg恶霜灵半抗原,加入5.0mg 1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和
3.7mg N‑羟基琥珀酰亚胺NHS;随后将上述物料使用N,N‑二甲基甲酰胺DMF溶解,室温搅拌,活化6h,得到活化液;另取15mg牛血清蛋白BSA溶解于3mL、0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液CB中;将制备所得活化液逐滴加入BSA溶液中,室温搅拌反应过夜后,采用PBS缓冲液透析3天,‑20℃分装保存,得到恶霜灵免疫原。
8.根据权利要求6所述恶霜灵完全抗原的制备方法,其特征在于包被原的制备,步骤如下:取3mg恶霜灵半抗原,再加入5.0mg 1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和
3.7mg N‑羟基琥珀酰亚胺NHS,将上述物料使用N,N‑二甲基甲酰胺DMF溶解,室温搅拌,活化
6h,得到活化液;另取10mg鸡卵白蛋白OVA溶解于3mL、0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液CB溶液中;将活化液逐滴加入OVA溶液中,室温搅拌反应过夜后,采用PBS缓冲液透析3天,‑20℃分装保存,得到恶霜灵包被原。
9.权利要求2所述恶霜灵单克隆抗体的应用,其特征在于:用于食品中恶霜灵残留的检测。
10.根据权利要求9所述恶霜灵单克隆抗体的应用,其特征在于:采用恶霜灵单克隆抗体制备恶霜灵的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条用于检测。