利索能及
我要发布
收藏
专利号: 2021101042675
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-03-02
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种分泌维生素B6单克隆抗体杂交瘤细胞株MTB,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,分类命名为单克隆细胞株,保藏日期2019年11月28日,保藏编号CGMCC No.19183。

2.一种维生素B6单克隆抗体,其特征在于:其由权利要求1所述CGMCC No.19183的杂交瘤细胞株MTB分泌产生。

3.维生素B6半抗原的制备方法,其特征在于化学反应方程式如下:步骤如下:

a、化合物2:化合物1和2,2‑二甲氧基丙烷溶解于丙酮,随后加入对甲苯磺酸,高温下搅拌过夜;将反应混合物冷却并倒入冰水中,二氯甲烷萃取水层,合并有机相,盐水洗涤,经Na2SO4干燥并浓缩,所需产物用乙醚重结晶,过滤混合物,得到白色固体化合物2;

b、化合物3:在氮气条件下,将NaH溶液加入到THF中,在此悬浮液中加入溶解于THF中的化合物2;将所得混合物回流,回流期间产生大量沉淀物,冷却至室温后,逐滴加入苄基溴,并将所得混合物再次回流;室温下向混合物加入冰,然后与饱和氯化铵溶液混合,二氯甲烷萃取;收集有机萃取物,用盐水洗涤,干燥,浓缩,得到深棕色油状物;再通过二氧化硅柱纯化,得到棕色油状化合物3;

c、化合物4:化合物3溶解在蒸馏水中,加入甲酸,混合物搅拌,用饱和碳酸氢钠溶液调节pH,中和后用二氯甲烷萃取三次,合并有机相,干燥并浓缩得到深棕色固体;粗产物通过柱色谱法纯化,得到白色固体化合物4;

d、化合物5:氮气条件下,将苄基二甲基苯基氯化铵溶解于无水甲醇,并加入甲醇钠,然后向该混合物中加入溶解于甲醇溶液的化合物4,室温下搅拌后,旋蒸上述混合物,倒入装有热甲苯的圆底烧瓶中,反应后,浓缩混合物,将反应中油状残余物溶于饱和氯化铵溶液,二氯甲烷萃取,合并有机相,干燥并浓缩;通过硅胶柱纯化,得到化合物5;

e、化合物6:化合物5溶解于二氯甲烷中,加入戴斯‑马丁氧化剂,室温搅拌过夜;将混合物倒入水中,乙胺萃取,合并有机层,盐水洗涤,经Na2SO4干燥浓缩,残余物通过硅胶柱纯化,得到黄色油状物化合物6;

f、化合物7:将化合物6和乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦在四氢呋喃THF溶液中搅拌过夜,将混合物浓缩,混合物通过硅胶柱纯化,得到黄色固体化合物7;

g、化合物8:化合物7溶于乙酸乙酯溶液,加入NaBH4搅拌,然后加入CaCl2,室温反应;将混合物倒入水中,用乙胺稀释,过滤,用乙胺冲洗固体,滤液用乙胺萃取,合并有机层,盐水洗涤,经Na2SO4干燥浓缩,残余物通过硅胶柱纯化,得到黄色油油状化合物8;

h、化合物9:在室温下,向化合物8的二氯甲烷溶液中加入甲磺酰氯和三乙醇胺,搅拌过夜;将混合物倒入水中,用二氯甲烷萃取水层,合并有机层,盐水洗涤,经Na2SO4干燥浓缩,残余物通过硅胶柱纯化,得到黄色油状物化合物9;

i、化合物10:在室温下向化合物9的二甲亚砜溶液中加入NaCN,搅拌过夜,将混合物倒入水中;乙胺萃取,合并有机层,盐水洗涤,经Na2SO4干燥浓缩,残余物通过硅胶柱纯化,得到黄色油状物化合物10;

j、化合物11:在室温下将化合物10在HCl/MeOH溶液中搅拌过夜,浓缩混合物,得到黄色油状物化合物11;

k、化合物12:向化合物11的MeOH的溶液中加入Pd(OH)2,室温氢气条件下搅拌过夜,过滤混合物并浓缩,得到黄色油状物化合物12;

l、化合物13:将化合物12溶于HCl中,室温搅拌过夜,过滤混合物并浓缩,得到棕色油状化合物13,即为维生素B6半抗原。

4.免疫原维生素B6‑KLH的制备方法,其特征在于步骤为:称取维生素B6半抗原溶解于N,N‑二甲基甲酰胺DMF中,加入N‑羟基琥珀酰亚胺NHS,室温反应;随后加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC,室温反应得到反应液A;取KLH溶液,加入碳酸盐‑碳酸氢盐缓冲液,得到溶液B;随后,逐滴将反应液A液加入到溶液B液中,室温反应,即得偶联物维生素B6‑KLH混合液,通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原,最终得到免疫原维生素B6‑KLH。

5.根据权利要求4所述免疫原维生素B6‑KLH的制备方法,其特征在于具体步骤如下:称取3.0mg维生素B6半抗原溶解于1mL DMF中,加入4.6mg NHS,室温反应15min;随后加入

7.67mg EDC,室温反应30min得到反应液A;取3mL、含有15mg KLH的溶液,加入3mL、pH 9.6碳酸盐‑碳酸氢盐缓冲液,得到溶液B;随后,逐滴将反应液A液加入到溶液B液中,室温反应8h,即得偶联物维生素B6‑KLH混合液,通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原维生素B6‑KLH。

6.包被原维生素B6‑OVA的制备方法,其特征在于步骤为:称取维生素B6半抗原溶解于N,N‑二甲基甲酰胺DMF中,加入N‑羟基琥珀酰亚胺NHS,室温反应;随后加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC,室温反应得到反应液C;称取鸡卵清白蛋白OVA,溶解于碳酸盐‑碳酸氢盐缓冲液中,得到溶液D;随后,逐滴将反应液C液加入到溶液D液中,室温反应,即得偶联物维生素B6‑OVA混合液,通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到包被原维生素B6‑OVA。

7.根据权利要求6所述包被原维生素B6‑OVA的制备方法,其特征在于具体步骤为:称取

1.5mg维生素B6半抗原溶解于1mL DMF,加入2.3mg NHS,室温反应15min;随后加入3.83mg EDC,室温反应30min得到反应液C;称取5mg OVA,溶解于2mL、pH 9.6碳酸盐‑碳酸氢盐缓冲液,得到溶液D;随后,逐滴将反应液C液加入到溶液D液中,室温反应8h,即得偶联物维生素B6‑OVA混合液,通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到包被原维生素B6‑OVA。

8.权利要求2所述维生素B6单克隆抗体的应用,其特征在于:建立维生素B6含量的免疫检测方法,应用于食品中维生素B6的检测。

9.根据权利要求8维生素B6单克隆抗体的应用,其特征在于:所述检测领域为婴幼儿、乳品和医学用途食品。