1.一种高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌,其特征在于,所述重组大肠杆菌敲除了大肠杆菌中丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB-focA、乳酸脱氢酶编码基因ldhA、磷酸转乙酰基酶编码基因pta中的一种或多种,并过量表达了磷酸烯醇式丙酮酸所激酶Pck和亚磷酸酯脱氢酶PtxD。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,编码所述的磷酸烯醇式丙酮酸激酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,编码所述的亚磷酸酯脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pck和亚磷酸酯脱氢酶ptxD是通过质粒pTrcHisA进行表达。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌FMME-N-5,于2020年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M 2020454。
5.一种权利要求1-4任一项所述重组大肠杆菌的构建方法,其特征在于,所述构建方法的步骤为:(1)构建pflB-focA、ldhA、pta基因敲除框片段;依次将基因敲除框片段转入带有pKD46质粒的宿主菌,筛选获得敲除目标基因的菌株;
(2)扩增获得磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pck和亚磷酸酯脱氢酶ptxD基因片段;将基因片段连接到表达载体上,然后将连接有基因片段的表达载体转入步骤(1)的菌株中,得到所述的重组大肠杆菌。
6.权利要求1-4任一项所述的大肠杆菌在生产琥珀酸的应用,其特征在于,所述的应用是采用所述的重组大肠杆菌在发酵培养基中进行有氧-厌氧两阶段发酵,得到含有琥珀酸的发酵液。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的有氧-厌氧两阶段发酵是在菌体OD600=52-60时,将有氧阶段转为厌氧阶段。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,将有氧阶段转为厌氧阶段是通过通入CO2气体或者添加10-20g/L碳酸氢盐的方式进行。
9.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,在厌氧阶段,控制葡萄糖浓度为5-15g/L。
10.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的有氧-厌氧两阶段发酵的接种量,按体积百分比计,为6-12%;发酵温度为35-38℃。