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专利号: 2018102713603
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述方法为:(1)转化反应:将待测菌株经发酵培养获得的湿菌体作为待测菌株样品加入底物反应液中,在10-

30℃、100-300rpm摇床反应20-120min,将反应液离心,获得上清液;所述底物反应液终浓度组成为:邻苯二酚2-15g/L,丙酮酸钠2-20g/L,乙酸铵5-50g/L,亚硫酸钠0.1-2g/L,EDTA-

2Na 0.1-2g/L,磷酸吡哆醛0.2-2mM,pH 7.0-8.0,溶剂为超纯水;(2)显色反应:取步骤(1)上清液加入显色反应液中,室温静置显色,在465nm处测吸光值,根据丙酮酸钠标准曲线,获得上清液中丙酮酸钠的含量,进而获得待测菌株样品中酪氨酸酚裂解酶的活力,从而筛选出酪氨酸酚裂解酶高活力菌株;所述显色反应液由10-250g/L氢氧化钠水溶液与水杨醛和超纯水以体积比3:0.1-3:5-10组成;所述标准曲线是在待测菌株检测相同条件下,将底物反应液与含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌转化反应后的上清液进行显色反应,以丙酮酸钠浓度为横坐标,以465nm处吸光值为纵坐标绘制而成。

2.如权利要求1所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述底物反应液终浓度组成为:邻苯二酚4-8g/L,丙酮酸钠4-10g/L,乙酸铵30-50g/L,亚硫酸钠0.5-1g/L,EDTA-2Na 1-2g/L,磷酸吡哆醛0.5-1mM,pH 7.0-8.0,溶剂为超纯水。

3.如权利要求1所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述显色反应液由250g/L氢氧化钠水溶液与水杨醛和超纯水以体积比3:0.1:6.7组成。

4.如权利要求1所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于步骤(2)所述显色反应按如下步骤进行:先后分别加入1ml 250g/L NaOH水溶液,200μL步骤(1)上清液,6.7ml超纯水,100μL水杨醛,2ml 250g/L NaOH水溶液,混合均匀,构成10ml显色反应体系,室温静置显色,在465nm处测吸光值。

5.如权利要求1所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述丙酮酸钠标准曲线按如下方法制备:(1)转化反应:将含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌湿菌体加入底物反应液中,30℃、150rpm摇床反应5min-5h,定时取样加入1M HCl终止反应后,于3000rpm离心10min,获得不同反应时间的上清液;所述底物反应液终浓度组成为:邻苯二酚5g/L、丙酮酸钠5g/L、乙酸铵50g/L、亚硫酸钠1g/L、EDTA-2Na2g/L、磷酸吡哆醛

1mM,溶剂为超纯水,pH 7.0-8.0;所述湿菌体加入终浓度为4g/L;

(2)显色反应:依次加入1mL 250g/L NaOH水溶液,200μL步骤(1)不同反应时间获得的上清液,6.7mL超纯水,100μL水杨醛,2mL 250g/L NaOH水溶液、900μL超纯水,混合均匀,构成显色反应体系10mL,室温下放置2h,用酶标仪于465nm测定吸光度,以吸光度为纵坐标,以丙酮酸钠浓度为横坐标,获得丙酮酸钠标准曲线。

6.如权利要求5所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌是将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的基因导入大肠杆菌获得的。

7.如权利要求1所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于待测菌株发酵方法为:将待测菌株接种至发酵培养基,在20-37℃,100-300rpm摇床培养6-

12h,获得湿菌体;所述发酵培养基组成为:蛋白胨5-20g/L,酵母粉2-10g/L,氯化钠2-10g/L,IPTG 10-30g/L,溶剂为水,pH值自然。

8.如权利要求7所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述待测菌株在发酵前先进行种子活化培养,再将种子液以体积浓度2-5%的接种量接种至发酵培养基,所述种子活化培养方法为:将待测菌株接种至种子培养基,在30-37℃,100-

300rpm摇床培养10-14h,获得种子液;所述种子培养基组成为:蛋白胨5-20g/L,酵母粉2-

10g/L,氯化钠2-10g/L,卡那酶素50-100μg/mL,溶剂为水,pH值自然。

9.如权利要求1所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述方法在96孔板中进行反应。

10.如权利要求9所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述方法为:(1)将待测菌株接种于装有种子培养基的深孔板Ⅰ中,于30-37℃,100-300rpm摇床培养10-14h,获得种子液;(2)将深孔板Ⅰ中的种子液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II中,于20-37℃,100-300rpm摇床培养6-12h;将深孔板II放置于孔板离心机,1000-

3000×g离心10-30min,弃去上清液;(3)在深孔板II中加入100-400μL底物反应液,10-30℃,100-300rpm摇床反应20min-2h,加入100-400μL 1M HCl终止反应;将深孔板II放置于孔板离心机,1000-3000×g离心10-30min,获得上清液;(4)向深孔板Ⅲ先后分别加入1ml 

250g/L NaOH水溶液,步骤(3)上清液200μL,6.7ml超纯水,100μL水杨醛,2ml 250g/L NaOH水溶液,混合均匀,构成10ml显色反应体系,室温下放置20min-2h进行显色反应,用酶标仪检测465nm处吸光值,根据丙酮酸钠标准曲线获得上清液中丙酮酸钠的含量,筛选获得含酪氨酸酚裂解酶活力提高的菌株。