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专利号: 2024112747809
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种酪氨酸酚裂解酶突变体,所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第18位或第417位进行单突变或多突变获得的。

2.如权利要求1所述的酪氨酸酚裂解酶突变体,其特征在于,所述酪氨酸酚裂解酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第18位苏氨酸突变为亮氨酸或第417位酪氨酸突变为天冬酰胺。

3.一种权利要求1所述酪氨酸酚裂解酶突变体的编码基因构建的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述酪氨酸酚裂解酶突变体在合成L‑酪氨酸衍生物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述应用的方法为:以含酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂,以苯酚衍生物(Ⅰ)、丙酮酸钠和乙酸铵为底物,以亚硫酸钠和EDTA·Na2为助剂,以磷酸吡哆醛为辅酶,以pH6.0~10.5的缓冲液为反应介质构成转化体系,在温度5~30℃、转速100~200rpm条件下进行转化反应,反应结束后,将反应液分离纯化,获得L‑酪氨酸衍生物(Ⅱ);

式(Ⅰ)中R单取代或多取代,R为H、2‑羟基、2,3‑二羟基,2‑F、3‑F;式(Ⅱ)中R同式(Ⅰ)中R。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述苯酚衍生物为苯酚、邻苯二酚、邻苯三酚、邻氟苯酚、间氟苯酚中的一种。

7.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述转化体系中,苯酚衍生物加入终浓度4~

50g/L,丙酮酸钠加入终浓度5~50g/L,乙酸铵加入终浓度7.7~108g/L,亚硫酸钠加入终浓度0.5~10g/L,EDTA·Na2加入终浓度0.5~10g/L,磷酸吡哆醛加入终浓度0.05~5mM,湿菌体用量为2~50g/L。

8.如权利要求5所述的应用,其特征在于,苯酚衍生物为邻苯二酚时,加入终浓度5~

50g/L;苯酚衍生物为苯酚时,加入终浓度4~40g/L;苯酚衍生物为邻苯三酚时,加入终浓度

5~50g/L;苯酚衍生物为邻氟苯时,加入终浓度5~50g/L;苯酚衍生物为间氟苯酚时,加入终浓度5~50g/L。

9.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述转化反应过程中对苯酚衍生物、丙酮酸钠和乙酸铵进行补料,每隔0.5~4h补料一次,其中苯酚衍生物每次补料0.1~10g/L,丙酮酸钠每次补料0.1~10g/L,醋酸铵每次补料1~20g/L。

10.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述催化剂按如下方法制备:

(1)斜面培养:将含酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的斜面培养基,在37℃培养8~16h,获得斜面菌体;所述斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化钠10g/L,20g/L琼脂,溶剂为蒸馏水,pH 7.0;

(2)种子培养:将斜面菌体接种至含50μg/mL卡那霉素的种子培养基,在37℃培养8~

10h,获得种子液;所述种子培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化钠10g/L,溶剂为蒸馏水,pH 7.0;

(3)发酵培养:将种子液以体积浓度2%的接种量接种至无菌的装有3L发酵培养基的5L机械搅拌通风通用式发酵罐中,将已灭菌的乳糖以终浓度为15g/L的量直接添加到发酵罐3

中,于28℃、搅拌转速300rpm、通气量5m/h、pH控制为5.5下诱导培养6~8h后,放罐,收集湿菌体;所述发酵培养基终浓度组成为:蛋白胨25g/L,酵母粉6.55g/L,NaCl10g/L,蔗糖9.1g/L,磷酸吡哆醛(PLP)0.05mM,MgSO4 5mM,KH2PO4 10mM,溶剂为蒸馏水,pH自然。