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专利号: 2017110151228
申请人: 福建省农业科学院植物保护研究所
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-27
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1. 一种快速检测茶树炭疽病菌的LAMP引物,其特征在于,所述的引物为外引物F3、B3和内引物FIP、BIP,其引物的核酸序列分别为:F3: 5’‑ CCGTCAATCATCGACCTCCT‑3’,B3: 

5’‑  TCTCGTCACGTACCAGAAGG ‑3’,FIP:  5’‑  CTTACGCACTGGCCGGTCTG‑GGAATGTTTTGCTGACTGCG‑3’,BIP: 5’‑ CCGAGTCAAATCCAACCGCCT‑GCACCAATCTGGTTACCCTG‑ 

3’。

2.一种LAMP法检测茶树炭疽病菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)提取待测样品基因组DNA:采用CTAB法或用市售的DNA提取试剂盒,按操作步骤提取待测样品中DNA;

(2)LAMP反应体系的建立:以步骤(1)提取的DNA为模板,利用权利要求1所述的外引物F3、B3和内引物FIP、BIP进行LAMP扩增,LAMP检测反应体系为25 μL,在200 μLPCR管中加入下列试剂:5 μM外引物F3和B3各1.0 μL,40 μM内引物FIP和BIP各1.0 μL,LAMP反应混合液

12.5μL,8 U Bst聚合酶1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用灭菌超纯水补足至25μL;

(3)LAMP反应条件:将配制好反应体系的PCR管于63℃水浴锅中恒温反应60 min,然后

80℃下反应5 min 终止反应;

(4)反应结果的测定:采用荧光染料目测观察法,待LAMP反应结束后,在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL,静置5min进行显色观察,在常光下观察到绿色荧光的判断为阳性,存在茶树炭疽病菌,橙色或橘黄色判断为阴性,不存在茶树炭疽病菌,在紫外光下若观察到浑浊状沉淀则判断为阳性,存在茶树炭疽病菌,澄清透明则判断为阴性,不存在茶树炭疽病菌。

3. 根据权利要求2所述的一种LAMP法检测茶树炭疽病菌的方法,其特征在于,LAMP反应混合液由以下组分组成:40 mM Tris‑HCl,20 mM (NH4)2SO4,20 mM KCl,16 mM MgSO4,

1.6 mol/L甜菜碱,2.0 mM dNTPs,0.2wt.% Trion X‑100。

4.如权利要求1所述的引物在茶树炭疽病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。