利索能及
我要发布
收藏
专利号: 2016110770153
申请人: 福建省农业科学院植物保护研究所
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-27
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种烟草赤星病菌的LAMP检测引物,其特征在于,所述引物包括如下:F3:5’-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3’;

B3:5’-GCGAGTCTCCAGCAAAGC-3’;

FIP:5’-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGAT-GAACGCAGCGAAATGCGA TA-3’;

BIP:5’-TGGTATTCCAAAGGGCATGCCT-GACAAGACGCCCAACACC- 3’ 。

2.一种烟草赤星病菌的LAMP检测方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)烟草赤星病菌LAMP检测引物设计:以烟草赤星病菌ITS序列为检测靶标,设计适合LAMP检测的特异性引物F3、B3、FIP和BIP,其核苷酸序列如下:F3:5’-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3’;

B3:5’-GCGAGTCTCCAGCAAAGC-3’;

FIP:5’-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGAT-GAACGCAGCGAAATGCGA TA-3’;

BIP:5’-TGGTATTCCAAAGGGCATGCCT-GACAAGACGCCCAACACC- 3’ ;

(2)待测样品DNA的提取:按照CTAB法或采用商品化试剂盒提取待测样品基因组DNA;

(3)LAMP扩增反应:以步骤(2)提取的待测样品DNA为模板,用步骤(1)的引物进行LAMP反应,LAMP检测反应体系为25 μL,包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL,40 μM引物FIP和BIP各

1.0 μL,LAMP反应混合液12.5μL,8 U Bst聚合酶1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用灭菌超纯水补足至25μL;LAMP反应条件:64 ℃温育60 min;

(4)反应结果的测定:采用荧光染料目测观察法进行测定,待LAMP反应结束后,在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ 1.0 μL,显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性,存在烟草赤星病菌,橙色或橘黄色判断为阴性,不存在烟草赤星病菌。

3. 根据权利要求2所述的一种烟草赤星病菌的LAMP检测方法,其特征在于,LAMP反应混合液由以下组分组成:40 mM Tris-HCl,20 mM (NH4)2SO4,20 mM KCl,16 mM MgSO4,1.6 mol/L甜菜碱,2.0 mM dNTPs,0.2wt.% Trion X-100。

4.如权利要求1所述的引物在烟草赤星病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。