1.一种烟草赤星病菌的LAMP检测引物,其特征在于,所述引物包括如下:F3:5’-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3’;
B3:5’-GCGAGTCTCCAGCAAAGC-3’;
FIP:5’-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGAT-GAACGCAGCGAAATGCGA TA-3’;
BIP:5’-TGGTATTCCAAAGGGCATGCCT-GACAAGACGCCCAACACC- 3’ 。
2.一种烟草赤星病菌的LAMP检测方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)烟草赤星病菌LAMP检测引物设计:以烟草赤星病菌ITS序列为检测靶标,设计适合LAMP检测的特异性引物F3、B3、FIP和BIP,其核苷酸序列如下:F3:5’-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3’;
B3:5’-GCGAGTCTCCAGCAAAGC-3’;
FIP:5’-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGAT-GAACGCAGCGAAATGCGA TA-3’;
BIP:5’-TGGTATTCCAAAGGGCATGCCT-GACAAGACGCCCAACACC- 3’ ;
(2)待测样品DNA的提取:按照CTAB法或采用商品化试剂盒提取待测样品基因组DNA;
(3)LAMP扩增反应:以步骤(2)提取的待测样品DNA为模板,用步骤(1)的引物进行LAMP反应,LAMP检测反应体系为25 μL,包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL,40 μM引物FIP和BIP各
1.0 μL,LAMP反应混合液12.5μL,8 U Bst聚合酶1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用灭菌超纯水补足至25μL;LAMP反应条件:64 ℃温育60 min;
(4)反应结果的测定:采用荧光染料目测观察法进行测定,待LAMP反应结束后,在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ 1.0 μL,显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性,存在烟草赤星病菌,橙色或橘黄色判断为阴性,不存在烟草赤星病菌。
3. 根据权利要求2所述的一种烟草赤星病菌的LAMP检测方法,其特征在于,LAMP反应混合液由以下组分组成:40 mM Tris-HCl,20 mM (NH4)2SO4,20 mM KCl,16 mM MgSO4,1.6 mol/L甜菜碱,2.0 mM dNTPs,0.2wt.% Trion X-100。
4.如权利要求1所述的引物在烟草赤星病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。