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专利号: 2022102720567
申请人: 湖南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种叶斑病病原菌的LAMP检测引物,其特征在于:所述引物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP,所述引物系列如下:

F3:5’‑ACCAGTGCGGTGGTATCG‑3’;

B3:5’‑CAAGAGCGCCTGTCACTC‑3’;

FIP:5’‑GGATCGATGGGAAGAAGGGCGCAAGCGAACCATCGAGAAGT‑3’;

BIP:5’‑CATACGACGACTCGACAAGCGCCCACCACCCAAAAAAACGAC‑3’。

2.一种叶斑病病原菌的LAMP检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的叶斑病病原菌的LAMP检测试剂盒,其特征在于:试剂盒还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、10×isothermal amplificationbuffer和MgSO4。

4.一种包含权利要求1所述引物的叶斑病病原菌的LAMP检测反应体系,其特征在于:反应体系包括:10uM的FIP和BIP引物各4μL,10uM F3和B3引物各0.5μL,10mM dNTPs 

2.5μL,8U/μL Bst DNA聚合酶1μL,50mM MgSO44μL,10×isothermal amplificationbuffer 

2.5μL,用灭菌超纯水补平至25μL。

5.一种基于权利要求4所述反应体系的叶斑病病原菌的LAMP检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

S1:获取叶斑病病原菌的EF‑1α基因保守区利用Primer Explore V5在线设计引物;

S2:制备25μL的权利要求4中的检测反应体系;

S3:将待测样品总DNA于S2所述的检测反应体系中进行LAMP扩增,反应结束后,取反应产物;

S4:将反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测;或/和用SYBR GreenI染料观察LAMP反应液变化;

S5:LAMP反应产物在琼脂糖凝胶电泳出现连续呈弥散状条带为阳性,存在叶斑菌病原菌;和/或反应液呈现翠绿色为阳性,存在叶斑病病原菌,淡橙色为阴性,不存在叶斑病病原菌。

6.根据权利要求5所述的LAMP检测方法,其特征在于,所述反应体系中的反应条件为:温度为60℃、反应时间为60min。

7.根据权利要求5所述的LAMP检测方法,其特征在于,所述S1中获取叶斑病病原菌的操作步骤如下:步骤一:剪取罹病叶片病健交界部分的组织进行消毒,再用无菌水漂洗,用无菌滤纸吸干水分后将其放置于含有链霉素的PDA平板上,26℃黑暗培养;

步骤二:将长出的菌落转接至PDA培养基,通过单孢分离进行纯化后用PDA斜面保存于4℃备用,得到分离纯化的菌株。

8.根据权利要求7所述的LAMP检测方法,其特征在于,还包括对叶斑病病原菌的鉴定,包括以下步骤:

Sa:将分离纯化的菌株接种于PDA培养基中培养出菌丝,然后提取真菌DNA;

Sb:通过引物ITS4/ITS5和EF1‑728F/EF1‑986R扩增核糖体转录间区和翻译延长因子基因部分序列;

Sc:构建PCR反应体系,该PCR反应体系为2×Es Taq Master Mix25μL、总DNA模板2μL、

10μM上下游引物各2μL、ddH2O 19μL,扩展反应取反应产物;

Sd:反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测后,进行序列测定,获序列在NCBI数据库进行BLASTN比对分析,利用MEGA6软件中邻接法构建系统发育树。

9.根据权利要求8所述的LAMP检测方法,其特征在于,PCR反应条件94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,共35个循环;最后72℃延伸10min,4℃保存。

10.根据权利要求2所述的试剂盒在植物叶斑菌病原菌鉴定中的应用,所述植物为黄花菜。