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专利号: 2015101772583
申请人: 浙江海洋学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-10-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1. 带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法,其特征在于包括以下步骤:1)带鱼鱼骨的预处理:将带鱼鱼骨按照料液比1g:15~20mL加入到0.1mol/L的NaOH溶液于1~4℃下浸泡2~

4h,脱除非胶原蛋白;将经NaOH溶液处理后的带鱼鱼骨用蒸馏水洗涤至中性并沥干,再按照料液比1g:5mL至1g:8mL加入pH 7.4的EDTA溶液,于1~4℃下浸泡2~3天,每天更换1次EDTA溶液,蒸馏水洗涤2~3次,干燥、粉碎,得脱钙带鱼鱼骨粉;2)带鱼鱼骨胶原蛋白的制备:将脱钙带鱼鱼骨粉按照料液比1g:5~8mL加入到0.5mol/L乙酸溶液并在1~4℃下动态浸泡

3d,10000g离心20~25min,取上清液,并加入NaCl至溶液终浓度为1.0mol/L,静置60~

90min,12000g离心25~30min得沉淀物,冷冻干燥即为带鱼鱼骨胶原蛋白;3)带鱼鱼骨胶原蛋白的酶解:将带鱼鱼骨胶原蛋白按照料液比1g:20~25mL加入到pH 7.0、浓度0.2mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液,按照胶原蛋白质量的1.5~2.0%向溶液中加入1000LAPU/g的复合风味蛋白酶,于温度45~50℃酶解4~6h后,将溶液升温至90~95℃,并于此温度保持10~15min后,冷却至45~50℃;按照胶原蛋白质量的1.2~1.5%向溶液中加入1.0×

105U/g的中性蛋白酶,于温度45~50℃下酶解4~6h,将溶液升温至90~95℃,并于此温度保持10~15min后,8000g离心25~30min,取上清液,即为酶解产物;4)带鱼鱼骨铁螯合胶原肽的制备:将制备的酶解产物采用1kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于1kDa部分,得超滤酶解液,超滤酶解液依次经固定化铁离子亲和层析和反相高效液相色谱纯化,得到带鱼鱼骨铁螯合胶原肽;所述步骤1)的带鱼为带鱼Trichiurus haumela;所述步骤4)的固定化铁离子亲和层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为:固定化铁离子亲和层析:将所述超滤酶解液溶于双蒸水配成浓度为10~20mg/mL的溶液,经过固定化铁离子Sepharose 

6B亲和层析柱吸附后,用5~8倍柱体积双蒸水洗脱除去未吸附多肽,然后用3~5倍柱体积的pH 3.0的双蒸水洗脱层析柱,收集洗脱液,冻干,得亲和层析酶解物;反相高效液相色谱纯化:将所述的亲和层析酶解物用双蒸水配成80~100μg/mL的溶液,利用反相高效液相色谱进行纯化,根据对铁离子的螯合活性得到1个高Fe螯合活性胶原肽Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly;进样量15~20μL;色谱柱是规格为250×4.6mm,5μm的Zorbax C18色谱柱;流动相为25%乙腈;洗脱速度为1.0~1.5mL/min;紫外检测波长为214nm。

2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述步骤1)采用的EDTA溶液的浓度为

0.5mol/L。