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专利号: 2024116833273
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种烯烃还原酶SeER突变体,其特征在于,所述烯烃还原酶SeER突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14之一所示。

2.一种权利要求1所述烯烃还原酶突变体在立体互补还原烯烃化合物合成R‑构型手性化合物中的应用,其特征在于,所述应用的方法为:将烯烃还原酶突变体的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或纯化酶为催化剂,以葡萄糖脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或者纯化酶冻干粉为辅酶,以前手性烯烃化合物为底物,以葡萄糖为辅底物,以二甲基亚砜为助溶剂,采用pH5 9的缓冲液为反应介质构成反应体系,25 40℃、1000 rpm条件~ ~下进行反应,反应结束,反应液经分离纯化,获得R‑构型手性产物;

所述烯烃化合物为下列之一:(Z)‑3‑氰基‑3‑苯基丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑苯基丙烯酸乙酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑苯基丙烯酸异丙酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑苯基丙烯酸叔丁酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(2‑氟苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(3‑氯苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(间甲苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑甲氧基苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑甲基苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑氟苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑氯苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑溴苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑三氟甲基苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑([1,1'‑联苯基]‑4‑基)‑3‑氰基丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(萘‑2‑基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑(3‑溴‑4‑甲氧基苯基)‑3‑氰基丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(3,4‑二氯苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(3,4‑二氟苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(3,5‑二氯苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(3,5‑二氟苯基)丙烯酸甲酯、(E)‑3‑氰基‑3‑(噻吩‑2‑基)丙烯酸甲酯,(Z)‑3‑氰基‑5‑甲基己‑2‑烯酸乙酯;

所述烯烃还原酶SeER突变体氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

3.一种权利要求1所述烯烃还原酶突变体在立体互补还原烯烃化合物合成S‑构型手性化合物中的应用,其特征在于,所述应用的方法为:将烯烃还原酶突变体的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或纯化酶为催化剂,以葡萄糖脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或者纯化酶冻干粉为辅酶,以前手性烯烃化合物为底物,以葡萄糖为辅底物,以二甲基亚砜为助溶剂,采用pH5 9的缓冲液为反应介质构成反应体系,25 40℃、1000 rpm条件~ ~下进行反应,反应结束,反应液经分离纯化,获得S‑构型手性产物;

所述烯烃化合物为下列之一:(Z)‑3‑氰基‑3‑苯基丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑苯基丙烯酸乙酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑苯基丙烯酸异丙酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑苯基丙烯酸叔丁酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(2‑氟苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(3‑氯苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(间甲苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑甲氧基苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑甲基苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑氟苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑氯苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑溴苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(4‑三氟甲基苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(萘‑2‑基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑(3‑溴‑4‑甲氧基苯基)‑3‑氰基丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(3,4‑二氯苯基)丙烯酸甲酯、(Z)‑3‑氰基‑3‑(3,4‑二氟苯基)丙烯酸甲酯、(E)‑3‑氰基‑3‑(噻吩‑2‑基)丙烯酸甲酯,(Z)‑3‑氰基‑5‑甲基己‑2‑烯酸乙酯;

所述烯烃还原酶SeER突变体氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示。

4.如权利要求2或3所述的应用,其特征在于,所述的反应体系中,底物加入终浓度1 20 ~

mM;葡萄糖加入终浓度1 50 mM;催化剂用量以湿菌体重量计为10 30g/L或者以纯化酶中蛋~ ~

白含量计为0.01 2.5g/L;所述辅酶EsGDH以纯化酶冻干粉重量计为0.5 2 g/L;二甲基亚砜~ ~

体积加入浓度5 10%;所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

~

5.一种权利要求1所述烯烃还原酶SeER突变体在催化立体互补还原(Z)‑3‑氰基‑3‑苯基丙烯酸甲酯合成菲尼布特中的应用,其特征在于,所述的应用为:以含烯烃还原酶SeER突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或纯化酶为催化剂,以含葡萄糖脱氢酶编码基因工程菌经发酵培养获得的纯化酶冻干粉为辅酶,以(Z)‑3‑氰基‑3‑苯基丙烯酸甲酯为底物,以二甲基亚砜为助溶剂,以pH5 9缓冲液为反应介质,在25 40℃、1000 rpm条件下~ ~进行反应,反应结束,反应液经分离纯化,获得(R)‑3‑氰基3‑苯基丙酸甲酯;(R)‑3‑氰基3‑苯基丙酸甲酯经过硼氢化钠还原,盐酸水解合成菲尼布特盐酸盐;所述烯烃还原酶SeER突变体氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

6.一种权利要求1所述烯烃还原酶SeER突变体在催化立体互补还原(Z)‑3‑(4‑氯苯基)‑3‑氰基丙烯酸甲酯合成巴氯芬中的应用,其特征在于,所述的应用以含烯烃还原酶SeER突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或纯化酶为催化剂,以含葡萄糖脱氢酶编码基因工程菌经发酵培养获得的纯化酶冻干粉为辅酶,以(Z)‑3‑(4‑氯苯基)‑3‑氰基丙烯酸甲酯为底物,以二甲基亚砜为助溶剂,以pH5 9缓冲液为反应介质,在25 40℃、~ ~

1000 rpm条件下进行反应,反应结束,反应液经分离纯化,获得(R)‑3‑(4‑氯苯基)‑3‑氰基丙酸甲酯;(R)‑3‑(4‑氯苯基)‑3‑氰基丙酸甲酯经过硼氢化钠还原,盐酸水解合成巴氯芬盐酸盐;所述烯烃还原酶SeER突变体氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

7.一种权利要求1所述烯烃还原酶SeER突变体在催化立体还原(Z)‑3‑(4‑甲苯基)‑3‑氰基丙烯酸甲酯合成托利布特中的应用,其特征在于,所述的应用以含烯烃还原酶SeER突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或纯化酶为催化剂,以含葡萄糖脱氢酶编码基因工程菌经发酵培养获得的纯化酶冻干粉为辅酶,以(Z)‑3‑(4‑甲苯基)‑3‑氰基丙烯酸甲酯为底物,以二甲基亚砜为助溶剂,以pH5 9缓冲液为反应介质,在25 40℃、1000 rpm~ ~条件下进行反应,反应结束,反应液经分离纯化,获得(R)‑3‑(4‑甲苯基)‑3‑氰基丙酸甲酯;

(R)‑3‑(4‑甲苯基)‑3‑氰基丙酸甲酯经过硼氢化钠还原,盐酸水解合成托利布特盐酸盐;所述烯烃还原酶SeER突变体氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

8.一种权利要求1所述烯烃还原酶SeER突变体在催化立体还原(Z)‑3‑氰基‑5‑甲基己‑

2‑烯酸乙酯合成普瑞巴林中的应用,其特征在于,所述的应用以含烯烃还原酶SeER突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或纯化酶为催化剂,以含葡萄糖脱氢酶编码基因工程菌经发酵培养获得的纯化酶冻干粉为辅酶,以(Z)‑3‑氰基‑5‑甲基己‑2‑烯酸乙酯为底物,以二甲基亚砜为助溶剂,以pH5‑9缓冲液为反应介质,在25 40℃、1000 rpm条件下进~行反应,反应结束,反应液经分离纯化,获得(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸乙酯;(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸乙酯经过硼氢化钠还原,盐酸水解合成普瑞巴林盐酸盐;所述烯烃还原酶SeER突变体氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示。