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专利号: 2022112646917
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种烯还原酶突变体,其特征在于,所述烯还原酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种权利要求1所述烯还原酶突变体编码基因。

3.一种含权利要求1所述烯还原酶突变体编码基因的重组载体。

4.一种权利要求3所述重组载体构建的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述烯还原酶突变体在催化(5R)‑香芹酮制备手性化合物(2R,5R)‑二氢香芹酮中的应用。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的应用为:将含烯还原酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎,取破碎混合液离心后的上清液或+上清液提取的纯酶液为催化剂,以 (5R)‑香芹酮为底物,以NAD(P) 为辅因子,以葡萄糖脱氢酶为辅酶,以葡萄糖为辅助底物,以pH6‑9的缓冲液为反应介质构成反应体系,在30‑ 40 ℃,180‑ 250 rpm转速的摇床中反应12 ‑ 48 h,反应完全后,使用乙酸乙酯对反应液进行萃取,再用无水硫酸镁脱水后,获得手性产物(2R,5R)‑二氢香芹酮。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述反应体系中,催化剂用量以蛋白含量计+

为0.1‑ 5 mg/mL,所述底物加入终浓度2‑ 10 mM,所述NAD(P) 加入终浓度0.01‑1.0 mM,所述辅酶加入终浓度0.2‑ 2 U/mL,所述辅助底物加入终浓度为30‑100 mM。

8.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述湿菌体按如下方法制备:将含烯还原酶突变体编码基因的重组基因工程菌平板单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,180rpm振荡培养15‑20h;再将菌液以体积浓度1%的接种量接种至新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,180rpm振荡培养至OD600nm达到0.6‑0.8;向培养液中加入终浓度0.2mM的IPTG,于25℃,180rpm振荡诱导培养12h,1,0000rpm离心10min,沉淀用无菌水悬浮洗涤,收集湿菌体。

9.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述纯酶液按如下方法制备:将湿菌体用50 mM、pH 8.0的PBS缓冲液悬浮后于4℃低温冰水浴下超声波破碎菌体,超声波破碎条件为,功率400W,3s开,4s关,温度为4℃,有效破碎时间为8min;超声波破碎混合液经12,000rpm离心

10min后再将上清经12000转离心20min得到上清液,吸取上清,获得含有目的烯还原酶突变体的粗酶液;将所得的粗酶液上样至Ni‑NTA金属螯合亲和层析柱,依次用含5mM咪唑、50mM咪唑、含100mM咪唑和250mM咪唑的洗脱液进行洗脱,收集含目的蛋白的流出液,用截留分子量为10kDa的超滤管在4℃和7000rpm下离心30min进行脱盐浓缩,取截留液即为纯酶液;所述洗脱液组成:300mM氯化钠,溶剂为50mM的PBS缓冲液,pH 8.0。