1.一种甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶突变体,其特征在于,所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第233位精氨酸突变为丙氨酸获得的。
2.一种权利要求1所述甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶突变体的编码基因。
3.一种含权利要求2所述编码基因的重组载体。
4.一种由权利要求3所述重组载体构建的重组菌。
5.如权利要求4所述的重组菌,其特征在于,所述重组菌按如下方法构建:将所述甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶突变体的编码基因,通过EcoRI和BamHI双酶切后连接插入到质粒fbrpRSFDuet‑1的多克隆位点MCS1,同时将metA 基因插入通过KpnI和XhoI双酶切后连接插入fbr到该质粒的另一个MCS2位点后,转入E.coli‑ΔBBIJ‑TrcmetL‑TrcthrA 感受态细胞,涂布含50μg/ml卡那霉素的LB平板,37℃培养过夜后,挑取阳性转化子接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养过夜后,获得重组菌;所述E.coli‑ΔBBIJ‑TrcmetL‑fbr fbrTrcthrA 是将大肠杆菌基因组中metI、metJ、metB、thrB基因敲除后,再将thrA 和metL基因的启动子替换成Trc强启动子构建获得的。
6.一种权利要求1所述甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶突变体在提高O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸产量中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述应用的方法为:将权利要求5所述重组菌接种至含50μg/mL卡那霉素的发酵培养基中,37℃、180rmp培养3h后,加入终浓度0.5mmol/L乳糖,置于30℃诱导培养48h,离心,取上清,分离纯化,获得O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸;所述发酵培养基组成为:葡萄糖为20g/L,酵母粉2.5g/L,(NH4)2SO4 16g/L,KH2PO4 2g/L,L‑苏氨酸
0.23g/L,L‑蛋氨酸0.1g/L,琥珀酸1g/L,柠檬酸2g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,FeSO4·4H2O
0.01g/L,MnSO4 0.005g/L,ZnSO4 0.0025g/L,L‑精氨酸0.004g/L,L‑谷氨酸0.003g/L,溶剂为去离子水,pH值自然。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,重组菌采用发酵罐发酵培养的方法为:将重组菌接种到装有2L含终浓度50μg/ml卡那霉素的发酵培养基的5‑L发酵罐中,初始转速
400rpm,初始通气流量为1.0L/min,随着菌体浓度增加调节转速和通气流量,以维持溶氧值在20~30%空气饱和度,用体积浓度为50%浓氨水和50%磷酸调节pH稳定在6.8‑7.0,37℃培养8‑12h后加入终浓度0.5mmol/L乳糖并降温至30℃诱导表达,继续培养至100‑120h;发酵过程中流加补料培养基维持葡萄糖浓度在1‑5g/L;发酵结束后,发酵液离心,留取上清,分离纯化,获得O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸;
所述发酵培养基的组成为:葡萄糖为20g/L,酵母粉2.5g/L,(NH4)2SO4 16g/L,KH2PO42g/L,L‑苏氨酸0.23g/L,L‑蛋氨酸0.1g/L,琥珀酸1g/L,柠檬酸2g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,FeSO4·4H2O 0.01g/L,MnSO4 0.005g/L,ZnSO4 0.0025g/L,L‑精氨酸0.004g/L,L‑谷氨酸
0.003g/L,CaCO3 10g/L,溶剂为去离子水,pH值自然;
所述补料培养基的组成为:葡萄糖500g/L,(NH4)2SO4 16g/L,KH2PO4 2g/L,L‑苏氨酸1g/L,L‑蛋氨酸0.05g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,MnSO4 0.005g/L,FeSO4·4H2O 0.01g/L,ZnSO4
0.0025g/L,L‑精氨酸0.004g/L,L‑谷氨酸0.003g/L,溶剂为自然水。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述重组菌接种发酵罐前,先进行斜面活化、种子扩大培养,将种子液以体积浓度5‑10%的接种量接种至发酵罐培养基,所述种子液按如下方法制备:(1)平板培养:用接种环从甘油管中挑取重组菌,在终浓度为50μg/ml卡那抗性的LB固体平板上进行划线接种,用封口膜密封后放置在37℃恒温培养箱中培养12‑16h;LB固体平板培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,琼脂粉15g/L,溶剂为去离子水,pH 7.0;
(2)斜面液体培养:用接种环从步骤(1)平板挑取单菌落接种至含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中,置于37℃,150rpm的恒温震荡摇床中培8‑12h进行活化;所述LB液体培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,溶剂为去离子水,pH
7.0;
(3)种子培养:将步骤(2)已活化好的菌液以体积浓度2%的接种量接种至含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中,置于37℃恒温摇床培养8‑12h,获得种子液。