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专利号: 2024110578276
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种对甲硫醇钠耐受性提高的O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸巯基转移酶突变体,其特征在于,所述O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸巯基转移酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列突变为下列之一:(1)第59位的苏氨酸突变为异亮氨酸,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;(2)第

59位的苏氨酸突变为异亮氨酸以及第119位的苏氨酸突变为酪氨酸,其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种含权利要求1所述突变体的编码基因的重组基因工程菌。

3.一种权利要求1所述O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸巯基转移酶突变体在催化甲硫醇钠生产L‑甲硫氨酸中的应用。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的应用为:以含所述O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸巯基转移酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶液为催化剂,以O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸和甲硫醇钠为底物,以pH7‑9的缓冲液为反应介质构成反应体系,在30℃,800rpm的恒温震荡金属浴中反应,反应液分离纯化,获得L‑甲硫氨酸。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述反应体系中,湿菌体加入量为5‑15g/L;

纯酶液加入量以蛋白浓度计为50‑150mg/L;O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸加入浓度20‑80g/L;甲硫醇钠加入的体积浓度为1‑15%。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述反应体系中还含有5′‑磷酸吡哆醛,加入终浓度为10‑50mM。

7.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述缓冲液为2M,pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液。

8.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述催化剂按如下方法制备:

(1)将含O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸巯基转移酶突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度

50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,在37℃、180r/min培养10‑12h,获得种子液;将种子液以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中,于37℃、

180r/min培养OD600至0.6~0.8,再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG,于28℃下诱导表达12h后,4℃、8000r/min离心10min,弃去上清液,收集湿菌体;

(2)将湿菌体用100mM,pH8.0的Tris‑HCl缓冲液重悬,采用超声破碎法进行破碎,冰浴破碎程序为:破碎时间3s,间隔时间4s,功率40W,破碎结束后,将细胞破碎液于4℃,

12000rpm离心20min,收集上清液;

(3)上清液经过0.22μm滤膜超滤后装载于Ni‑NTA凝胶柱,采用重力法控制流速上样,使用含有300mM NaCl,50mM咪唑的pH 8.0、50mM Tris‑HCl缓冲液洗脱,流速1.0mL/min,直至蛋白纯化仪上的紫外检测达到平衡;再使用含有300mM NaCl,50mM咪唑的pH 8.0、500mM Tris‑HCl缓冲液洗脱,流速1.0mL/min,收集目的蛋白的洗脱液;将洗脱液装入透析袋,以纯水为透析液,在4℃冰箱过夜透析,收集截流液,得到纯酶液。