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专利号: 2022110389186
申请人: 西南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.东莨菪内酯的酶法制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

A.制备含有F6’H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌;

B.将重组基因工程菌活化、发酵后,以阿魏酸为底物再发酵培养转化得东莨菪内酯。

2.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法,其特征在于,所述F6’H1基因的序列如SEQ ID NO.1所示,所述阿魏酰辅酶A合成酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法,其特征在于,步骤A中制备重组基因工程菌的表达菌株为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

4.根据权利要求1‑3任一项所述的东莨菪内酯的酶法制备方法,其特征在于,步骤A重组基因工程菌的具体制备方法为:

1)将人工合成F6’H1基因构建至质粒pUC57,得到含有目的基因的质粒pUC57‑F6’H1;设计包含Bam HI酶切位点的上游引物F6‘H1‑BamHI‑F和包含Eco RI酶切位点的下游引物F6‘H1‑EcoRI‑R,以pUC57‑F6‘H1为模板,PCR扩增含有双酶切位点的F6‘H1基因:ggatcc+F6‘H1+gaattc;同样分别经BamHI和EcoRI双酶切载体pGEX‑6p‑1;将上述目的片段和载体用T4连接酶进行连接;连接完毕后,转化到宿主细胞感受态中;挑选含有F6’H1基因的阳性克隆;

2)将人工合成阿魏酰辅酶A合成酶基因构建至质粒pUC57,得到含有目的基因的质粒pUC57‑FCS;设计包含EcoRI酶切位点和核糖体结合位点rbs的上游引物FCS‑EcoRI‑rbs‑F和包含XhoI酶切位点的下游引物FCS‑XhoI‑R,以pUC57‑FCS为模板,PCR扩增含有双酶切位点和核糖体结合位点的FCS基因片段:ggatcc+aaggagatatacca+FCS+ctcgag;同样分别经BamHI和EcoRI双酶切载体pGEX‑F6‘H1;将上述目的片段和载体用T4连接酶进行连接;连接完毕后,转化到宿主细胞感受态中;最后得到含有F6’H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的东莨菪内酯的酶法制备方法,其特征在于,所述上游引物F6‘H1‑BamHI‑F的序列如SEQ ID NO.5所示;所述下游引物F6‘H1‑EcoRI‑R的序列如SEQ ID NO.6所示。

6.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法,其特征在于,所述上游引物FCS‑EcoRI‑rbs‑F的序列如SEQ ID NO.9所示;所述下游引物FCS‑XhoI‑R的序列如SEQ ID NO.10所示。

7.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法,其特征在于,步骤B中发酵具体为:将活化后的重组基因工程菌以1:20‑70的比例接种于LB培养基中,37℃,250rpm恒温培养直至OD600达到0.6‑0.8,加入IPTG至终浓度为0.8‑1.2mM,37℃,250rpm恒温继续培养4‑

12h。

8.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法,其特征在于,转化后还包括取发酵液加入同等体积的乙酸乙酯进行萃取得到东莨菪内酯。

9.一种用于制备东莨菪内酯的F6‘H1基因,其特征在于,所述F6’H1基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

10.一种用于制备东莨菪内酯的阿魏酰辅酶A合成酶基因,其特征在于,所述阿魏酰辅酶A合成酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。