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专利号: 2022109975425
申请人: 湖南工程学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测牛结核分枝杆菌的试剂,包括Cas12a、gRNA、scgRNA探针、杂交链式反应用探针和比色分析用试剂;

所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;

所述scgRNA探针由iDNA‑F、iDNA‑B和Initiator组装得到;所述iDNA‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述iDNA‑B的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述Initiator的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;

所述杂交链式反应用探针包括H1、H2、H3和H4;所述H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;所述H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;

所述比色分析用试剂包括氯化血红素、H2O2和ABTS。

2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述iDNA‑F、iDNA‑B和Initiator的摩尔比为(1.1~1.3):(1.1~1.3):1。

3.一种检测牛结核分枝杆菌的试剂盒,包括权利要求1或2所述的试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性对照;所述阳性对照品包括Target探针;所述Target探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述Cas12a的工作浓度为5μM;所述gRNA的工作浓度为10μM。

6.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述H1和H2的工作浓度分别为5μM;所述H3和H4的工作浓度分别为2μM。

7.一种基于权利要求1或2所述试剂或者权利要求3~6任意一项所述试剂盒的非诊断目的的牛结核分枝杆菌的检测方法,包括以下步骤:

1)分别孵育H1和H2,分别得到发夹结构的H1和H2,将待测样本、发夹结构的H1和发夹结构的H2混合,进行第一杂交链式反应,得到DNA纳米线性结构;

2)将所述DNA纳米线性结构、Cas12a、gRNA和scgRNA探针混合,进行识别切割反应,得到包含引发序列的产物;

3)分别孵育H3和H4,分别得到发夹结构的H3和H4,将所述包含引发序列的产物和发夹结构的H3、发夹结构的H4混合,进行第二杂交链式反应,得到G‑四链体;

4)将所述G‑四链体和氯化血红素混合,于黑暗条件下进行第一孵育,得到G‑四链体‑血红素DNA酶;将所述G‑四链体‑血红素DNA酶和H2O2、ABTS混合,进行第二孵育,得到第二孵育产物;对所述第二孵育产物进行固液分离,收集液体组分;

5)对所述液体组分进行紫外分光检测,获得在A420nm处的最大吸收峰,根据标准曲线获得待测样本中牛结核分枝杆菌的浓度值;

所述标准曲线是以牛结核分支杆菌DNA的浓度为自变量,以在A420nm处的校正后的最大吸收峰为因变量得到的标准曲线;

所述在A420nm处的校正后的最大吸收峰根据式1所示公式计算得到,ΔA420nm=A420nm‑A0,式1;其中ΔA420nm为在A420nm处的校正后的最大吸收峰;A420nm为实际测得的已知牛结核分支杆菌DNA靶标浓度的最大吸收峰,A0为结核分枝杆菌DNA靶标浓度为0时候的背景值。

8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述第一杂交链式反应的反应体系以

10μL计,包括以下组分:待测样品2μL、H14μL和H24μL。

9.根据权利要求7或8所述的检测方法,其特征在于,所述第一杂交链式反应的反应程序为:37℃、2h。

10.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述识别切割反应的反应程序为:37℃、2h,75℃、15min。