1.一种检测牛结核分枝杆菌的试剂,包括基于CRISPR/Cas12a正反馈循环机制的识别元件、超支化杂交链式反应信号放大反应用试剂和比色分析用试剂;
所述基于CRISPR/Cas12a正反馈循环机制的识别元件包括:gRNA‑T、Cas12a蛋白、辅助探针和可切换导向RNA;
所述可切换导向RNA由iDNA‑spacer、iDNA‑handle和gRNA组装得到;
所述gRNA‑T的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述辅助探针为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经碱基互补配对组成的双链;
所述iDNA‑spacer的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
所述iDNA‑handle的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;
所述超支化杂交链式反应信号放大反应用试剂包括探针H1、探针SH1、探针H2、探针L1、探针L2和探针SH2;所述探针H1、探针SH1、探针H2、探针L1、探针L2和探针SH2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.12所示;
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所述比色分析用试剂包括氯化血红素、H2O2和ABTS。
2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述iDNA‑spacer、iDNA‑handle和gRNA的摩尔比为(1.1 1.3):(1.1 1.3):1。
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3.一种检测牛结核分枝杆菌的试剂盒,包括权利要求1或2所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性对照;所述阳性对照品包括SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列碱基互补配对组成的目标序列。
5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述gRNA‑T的工作液浓度为50 nM;所述辅助探针的工作液浓度为500 nM;所述可切换导向RNA的工作液浓度为1 µM;所述Cas12a蛋白的工作液浓度为1 µM。
6.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述探针H1、探针SH1、探针H2、探针L1、探针L2或探针SH2的工作液浓度分别为1 µM。
7.一种基于权利要求1或2所述试剂或者权利要求3 6任意一项所述试剂盒的非诊断目~的的牛结核分枝杆菌的检测方法,包括以下步骤:
1)将待测样本和所述CRISPR/Cas12a正反馈循环机制的识别元件混合,进行正反馈识别切割反应,得到包含引发序列的第一产物;
2)将所述探针SH1、探针SH2、探针H1、探针H2分别溶解于缓冲液,分别进行第一孵育,分别得到发夹结构的SH1、SH2、H1、H2;
3)将所述第一产物、探针L1、探针L2和发夹结构的SH1、SH2、H1、H2混合,进行超支化杂交链式反应信号放大反应,得到第二产物;
4)将所述第二产物和氯化血红素混合,于黑暗条件下进行第二孵化,得到第二孵化产物;将所述第二孵化产物和H2O2、ABTS混合,进行第三孵化,得到第三孵化产物;对所述第三孵育产物进行固液分离,收集液体组分;
5)对所述液体组分进行紫外分光检测,获得在A420nm处的最大吸收峰,根据标准曲线获得待测样本中牛结核分枝杆菌的浓度值;
所述标准曲线是以牛结核分支杆菌DNA的浓度为自变量,以在A420nm处的校正后的最大吸收峰为因变量得到的标准曲线;
所述在A420nm处的校正后的最大吸收峰根据式1所示公式计算得到,ΔA420 nm=A420nm‑A0,式1;其中ΔA420 nm为在A420nm处的校正后的最大吸收峰;A420 nm为实际测得的已知牛结核分支杆菌DNA靶标浓度的最大吸收峰,A0为牛结核分枝杆菌DNA靶标浓度为0时候的背景值;
所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序限制。
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述正反馈识别切割反应的反应体系以20µL计,包括以下组分:8 µL正反馈反应缓冲溶液、50nM gRNA‑T 2µL、1 µM 可切换导向RNA 2 µL、500 nM 辅助探针 2 µL、1 µM Cas12a蛋白4 µL和待测样品2 µL。
9.根据权利要求7或8所述的检测方法,其特征在于,所述正反馈识别切割反应的反应程序为:37℃下反应4h,75℃处理15min。
10.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述超支化杂交链式反应信号放大反应的反应温度为20 30℃,反应时间为2 3h。
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