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专利号: 2022106779220
申请人: 湖南工程学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-01
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组,其特征在于,包括发夹

2+

型探针H1、发夹型探针H2、信号链S3和Pb ;

所述发夹型探针H1和发夹型探针H2均为茎环结构,所述发夹型探针H1和发夹型探针H2均含有8‑17DNAzyme碱基序列,所述发夹型探针H1环部区中心位置和信号链S3中心位置均有8‑

17DNAzyme特异性切割位点;

所述发夹型探针H1的茎部区游离3’端和环部区分别连接有a1区和b1区,所述a1区和b1区分别为与牛结核分枝杆菌靶序列5’端和3’端互补的碱基序列,所述发夹型探针H1还包含有引发链序列;

所述发夹型探针H2的环部区包含有与所述引发链互补的碱基序列,所述发夹型探针H2的游离3’端和茎部互补区分别连接有a2区和b2区,所述a2区和b2区分别为与所述信号链S3的

5’端和3’端互补的碱基序列;

所述信号链S3的两端分别连接有荧光基团和荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组,其特征在于,所述a1区基因序列如SEQ ID NO.1所示:GTCTGCACA;所述b1区基因序列如SEQ ID NO.2所示:TAGTCCTCT。

3.根据权利要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组,其特征在于,所述a2区基因序列如SEQ ID NO.3所示:AACTAAGA;所述b2区基因序列如SEQ ID NO.4所示:GAACTATCT。

4.根据权利要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组,其特征在于,所述发夹型探针H1的基因序列如SEQ ID NO.5所示:GGATCAAAAATAGTCCTCTACTrAGTCTTTTTTTTTGATCCGAGCCGGACGAAGTGTCTGCACA,该序列中rA为RNA碱基,为特异性切割位点;

所述牛结 核分枝杆 菌靶序 列的基因 序列如S EQ  I D  NO .8所示 :TGTGCAGACGGAGAGGACTAGATTTGTCAGA。

5.根据权利要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组,其特征在于,所述发夹型探针H2的基因序列如SEQ ID NO.6所示:GGAGATAGTTCAGTAGAGGACTATTTTTGATAAGAACTATCTCCGAGCCGGACGAAACTAAGA;

所述信号链S3的基因序列如SEQ ID NO.7所示:TCTTAGTTrAGGATAGTT,该序列中rA为RNA碱基,为特异性切割位点。

6.根据权利要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组,其特征在于,所述荧光基团为FAM基团,所述荧光淬灭基团为BHQ基团。

7.一种如权利要求1~6任一项所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、探针序列预处理:将探针H1、H2和信号链S3的冻干粉用缓冲溶液溶解,然后对探针H1、H2进行退火以形成茎环结构;

S2、双循环体系反应:取步骤S1中的缓冲溶液、退火后的探针H1、H2溶液与待检测样品混合加入EP管中混合均匀,然后避光加入信号链S3溶液混合反应,一步构建双循环反应体系;

S3、荧光值测定:将步骤S2混合反应液在黑暗条件下用荧光计进行检测,并记录下荧光值,通过荧光值判断待检测物是否含有牛结核分枝杆菌;

2+

所述缓冲溶液含有Pb 。

8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述缓冲液包括Tris‑HCl、NaCl和PbCl2。

9.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述步骤S1中退火温度设置为:95℃,

5min;85℃,5min;70℃,15min;65℃,15min;50℃,15min;40℃,15min;30℃,15min;25℃,

90min。

10.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述步骤S3中荧光计的激发波长为

470nm。