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专利号: 2023109971128
申请人: 湖南工程学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-08-18
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于8‑17脱氧核酶与CRISPR‑Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组,其特征在于,包括探针A、探针B、探针HX、探针gRNA、探针g、探针H1、探针H2、探针a、探针b和LwaCas13a酶;所述探针A含有8‑17脱氧核酶,所述gRNA与LwaCas13a、g序列结合形成

2+

CRISPR‑Cas13a系统;所述探针a含有G‑四链体二聚体序列;所述探针组在Pb 条件下通过多重信号放大实现对牛结核分枝杆菌靶标基因T的检测;

其中,所述探针A的基因序列如SEQ ID NO.1所示,探针B的基因序列如SEQ ID NO.2所示,探针HX的基因序列如SEQ ID NO.3所示,探针gRNA的基因序列如SEQ ID NO.4所示,探针g的基因序列如SEQ ID NO.5所示,探针H1的基因序列如SEQ ID NO.6所示,探针H2的基因序列如SEQ ID NO.7所示,探针a的基因序列如SEQ ID NO.8所示,探针b的基因序列如SEQ ID NO.9所示,靶标基因T的基因序列如SEQ ID NO.10所示,8‑17脱氧核酶功能序列如SEQ ID NO.11所示。

2.一种非诊疗目的牛结核分枝杆菌的检测方法,其特征在于,应用如权利要求 1 所述探针组,包括以下步骤:S1、探针序列预处理:分别将探针A、探针B、探针HX、探针gRNA、探针g、探针H1、探针H2、探针a、探针b冻干粉配置成母液,再分别用缓冲液将母液稀释;将稀释后的探针A、B母液混合后孵育形成探针A‑B;将稀释后的探针gRNA、HX母液混合后孵育形成探针HX‑gRNA;将稀释后的探针a、b母液混合后孵育形成探针a‑b;

S2、链置换释放脱氧核酶序列:将牛结核分枝杆菌待测样品与探针A‑B混匀反应;

S3、8‑17脱氧核酶与LwaCas13a对特异性探针的切割:在S2步骤反应结束后加入探针HX‑gRNA反应,之后加入LwaCas13a、g探针混合,并加入酶反应缓冲溶液后进行反应;

S4、形成G‑四链体二聚体结构:在S3反应结束后加入H1、H2、 a‑b探针、THT,加入缓冲溶液后避光进行反应;

S5、荧光检测:对S4反应结束后份溶液稀释后吸取样品于比色皿中上机检测,依据靶标基因T响应校准曲线计算待测样品的浓度。

3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述步骤S1中探针A、探针B、探针HX、探针gRNA、探针g、探针H1、探针H2、探针a、探针b母液稀释后的浓度比为4:4:2:2:1:1:1:2:

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2;所述缓冲溶液为pH=7.5,含有Pb 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液。

4.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述探针A‑B中探针A与探针B的摩尔比为1:1;所述探针HX‑gRNA中探针HX与探针gRNA的摩尔比为6:5;所述探针a‑b中探针a与探针b的摩尔比为1:1.1。

5.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述步骤S2中牛结核分枝杆菌待测样品与探针A‑B体积比为2:1,反应时间为1h。

6.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述步骤S3中HX‑gRNA探针、LwaCas13a和g探针的摩尔比为4:1:1;反应温度为37℃,反应时间3小时。

7.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述步骤S4中H1、H2、 a‑b探针和THT的摩尔比为11:11:10:100;反应温度为室温,反应时间1.5小时。

8.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述步骤S5中检测参数为:激发光光谱带宽15 nm,发射光光谱带宽15 nm,激发光波长420 nm。