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专利号: 2022102444571
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种无外源氨基酸作用下高产L‑甲硫氨酸的重组大肠杆菌,其特征在于所述重组大肠杆菌以E.coli W3110 M2/pAm为出发菌株,在基因组上对lysA基因进行原位回补,并将lysA基因的启动子替换为PfliA启动子,再在pAm的质粒上过表达gltA基因和malY基因获得的;

所述出发菌株E.coli W3110 M2/pAm基因型为E. coli W3110  ΔmetJ  ΔmetI  ΔlysA Trc‑metH Trc‑metF Trc‑cysE Trc‑serB Trc‑serC/pAm,质粒pAm为用ptrc99A质粒的trcfbr fbr强启动子增强metA 、yjeH、serA 基因;

所述PfliA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述lysA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,gltA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,malY基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述重组大肠杆菌,其特征在于所述重组大肠杆菌按如下步骤构建:

(1)以E.coli W3110 M2/pAm为出发菌株,应用CRISPR‑Cas9基因编辑技术将该工程菌基因组中lysA基因进行原位回补,得到工程菌E.coli W3110 M2‑lysA‑ATG/pAm;

(2)应用CRISPR‑Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli W3110 M2‑lysA‑ATG/pAm基因组中lysA基因的启动子替换为PfliA启动子,得到工程菌E.coli W3110 M2‑PfliA‑lysA/pAm;

(3)以菌株E.coli W3110 M2‑PfliA‑lysA/pAm为底盘菌株,在质粒上过表达大肠杆菌的gltA基因,将质粒转化到E.coli W3110 M2‑PfliA‑lysA中得到工程菌E.coli W3110 M2‑PfliA‑lysA/pAm gltA;

(4)以菌株E.coli W3110 M2‑PfliA‑lysA/pAm gltA为底盘菌株,在质粒上过表达大肠杆菌的malY基因,将质粒转化到E.coli W3110 M2‑PfliA‑lysA中得到重组大肠杆菌E.coli W3110 M2‑PfliA‑lysA/pAm gltA malY。

3.一种权利要求1所述重组大肠杆菌在无外源氨基酸作用下生产L‑甲硫氨酸的应用。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述的应用为:将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基,在25‑35℃、100‑200rpm条件下发酵培养,获得含L‑甲硫氨酸的发酵液;所述发酵培养基组成如下:葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O3 2g/L、酵母提取物

2g/L,CaCO3 10g/L、VB12 0.2μg/L、1mL/L微量元素溶液,溶剂为去离子水,pH值自然,其中CaCO3和VB12 在接种时加入;微量元素溶液组成为:MgSO4·7H2O 500g/L,FeSO4·7H2O 5g/L,MnSO4·8H2O 5g/L,ZnSO4 5g/L,溶剂为去离子水。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述重组大肠杆菌接种前先进行扩大培养,再将扩大培养的种子液以体积浓度1‑5%的接种量接种到发酵培养基,所述扩大培养是将所述重组大肠杆菌接种到含50mg/L卡那霉素的LB培养基中,37℃培养8‑12h,获得扩大培养液;

所述LB培养基:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 5g/L,溶剂为去离子水,pH值自然。