1.一种ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:CRISPR/Cas9技术ep400基因打靶位点gRNA‑1F和gRNA‑2F的合成;
步骤2:将Cas9 蛋白和gRNA组成预混体系,进行胚胎显微注射;
步骤3:斑马鱼ep400基因打靶位点gRNA‑1F和gRNA‑2F有效性检测;
步骤4:斑马鱼ep400基因F0代嵌合体筛选;
步骤5:斑马鱼ep400基因F1代基因敲除杂合子筛选;
步骤6:斑马鱼ep400基因F2代基因敲除纯合子筛选;
步骤7:斑马鱼ep400基因敲除纯合子中心力衰竭突变表型观察与分析。
2.根据权利要求1所述的ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建方法,其特征在于:步骤1中ep400基因打靶位点gRNA的设计及合成按照以下步骤进行:通过NCBI和Ensembl在线软件,在斑马鱼ep400基因第11和12号外显子序列处设计并合成独特的2个打靶位点gRNA,引物序列如下所示:gRNA‑1F:tgtaatacgactcactataggacctcgctgtcagatgtgggttttagagctagaaatagc、gRNA‑2F:tgtaatacgactcactataggtacaatagaagagcagggttttagagctagaaatagc。
3. 根据权利要求1所述的ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建方法,其特征在于:步骤2中注射体系中包含了2个打靶位点及Cas9蛋白,其中Cas9 蛋白的浓度为 5μg/μL,gRNA 的终浓度在80‑100 ng/μL之间。
4.根据权利要求1所述的ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建方法,其特征在于:步骤3和4中所述的检测和筛选是利用Sanger测序对两个打靶位点间的片段进行分析来检测2个打靶位点gRNA‑1F和gRNA‑2F的有效性及基因型。
5.根据权利要求1所述的ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建方法,其特征在于:步骤5和6中所述的2个有效的打靶位点gRNA‑1F和gRNA‑2F共注射敲除了斑马鱼ep400基因第11号和12号外显子间162bp片段,构建斑马鱼ep400基因F1代基因敲除杂合子和F2代基因敲除纯合子。
6.根据权利要求1所述的ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建方法,其特征在于:步骤7中观察并分析斑马鱼ep400基因敲除后纯合子心力衰竭突变表型按照以下步骤进行:利用斑马鱼心脏组织转基因荧光标记品系与ep400基因敲除品系杂交来构建心脏组织带有绿色荧光标记的ep400基因敲除品系,随后在共聚焦显微镜下观察,通过对荧光信号变化来分析ep400基因敲除导致心脏形态、心脏搏动及组织细胞结构表型变化情况,确定心力衰竭突变表型。