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专利号: 2022101839456
申请人: 湖南师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建及其应用的方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤1:CRISPR/Cas9技术ep400基因打靶位点gRNA(1F和2F)的合成;

步骤2:将Cas9 蛋白和gRNA组成预混体系,进行胚胎显微注射;

步骤3:斑马鱼ep400基因打靶位点gRNA(1F和2F)有效性检测;

步骤4:斑马鱼ep400基因F0代嵌合体筛选;

步骤5:斑马鱼ep400基因F1代基因敲除杂合子筛选;

步骤6:斑马鱼ep400基因F2代基因敲除纯合子筛选;

步骤7:斑马鱼ep400基因敲除纯合子中心力衰竭突变表型观察与分析。

2.根据权利要求1所述的ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建及其应用的方法,其特征在于:步骤1中ep400基因打靶位点gRNA的设计及合成按照以下步骤进行:通过NCBI和Ensembl在线软件,在斑马鱼ep400基因第11和12号外显子序列处设计并合成独特的2个打靶位点gRNA(1F和2F)。

3.根据权利要求1所述的ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建及其应用的方法,其特征在于:步骤2中注射体系中包含了2个打靶位点及Cas9蛋白,其中Cas9 蛋白的浓度为 

5μg/μL,gRNA 的终浓度在80‑100 ng/μL之间。

4.根据权利要求1所述的ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建及其应用的方法,其特征在于:步骤3和4中所述的检测位于斑马鱼ep400基因第11和12号外显子处的有效靶位点gRNA组合敲除斑马鱼ep400基因。

5.根据权利要求1所述的ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建及其应用的方法,其特征在于:步骤5和6中所述的gRNA组合敲除斑马鱼ep400基因第11号和12号外显子间

162bp片段(其中外显子76bp,内含子86bp),构建斑马鱼ep400基因F1代基因敲除杂合子和F2代基因敲除纯合子。

6.根据权利要求1所述的ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建及其应用的方法,其特征在于:步骤7中观察并分析斑马鱼ep400基因敲除纯合子中心力衰竭突变表型按照以下步骤进行:利用斑马鱼心脏转基因标记品系(如:Tg (cmlc2: EGFP),Tg  (cypher: EGFP))与ep400基因敲除品系杂交,在共聚焦显微镜下,通过对荧光信号变化来分析ep400基因敲除导致心脏形态、心脏搏动及组织细胞结构等突变表型,确定心力衰竭突变表型。