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专利号: 201910736732X
申请人: 湖南文理学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法,其特征在于,所述通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法包括以下步骤:第一步,通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列;

第二步,获得actRIIB基因和alk4基因gRNA;

第三步,体外转录获得Cas9 mRNA;

第四步,Cas9 mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA显微共注射;

第五步,F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定;

第六步,F2代纯合突变个体的获得,待F1代杂合突变个体性成熟后,F1代个体自交获得F2代;根据孟德尔定律,从F2中筛选出纯合突变个体。

2.如权利要求1所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法,其特征在于,所述第一步通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列包括;

actRIIB基因mRNA序列:NM_131210.3;

actRIIB基因基因组序列:NC_007135.7;

通过序列比对将敲除位点设计在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点,靶位点序列为SEQ ID NO:1;

alk4基因mRNA序列:NM_130990.1;

alk4基因基因组序列:NC_007134.7;

通过序列比对将敲除位点设计在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点,靶位点序列为SEQ ID NO:2。

3.如权利要求1所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法,其特征在于,所述第二步actRIIB基因和alk4基因gRNA的获得:以gRNA-plasmid为模板,分别以actRIIB-gRNA-F/gRNA-R和alk4-gRNA-F/gRNA-R为引物:利用KOD Plus高保真酶进行PCR扩增,扩增产物割胶回收,回收产物连接pMD18-T载体后转化感受态大肠杆菌,挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA;然后质粒DNA测序进行序列验证,序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板;再利用 T7TranscriptionKit将构建好的质粒体外逆转录20ul反应体系。

4.如权利要求3所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法,其特征在于,所述逆转录20ul反应体系为:

10x Reaction Buffer 2ul;

Plasmid DNA 4ul,1ug;

T7 Enzyme 2ul;

10mmol/L NTP 1ul;

DEPC water 11ul。

5.如权利要求3所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法,其特征在于,所述第三步体外转录获得Cas9 mRNA:Cas9质粒来自AddgeneTM,使用 T7/T3 Transcription Kit,合成Cas9 mRNA,体系及反应条件:

10x Reaction Buffer 2ul;

Plasmid DNA 4ul,1ug;

T7 Enzyme 2ul;

10mmol/L NTP 1ul;

DEPC water 11ul。

6.如权利要求3所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法,其特征在于,所述第四步Cas9 mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA显微共注射:首先配置显微注射体系如下:Cas9 mRNA 300ng/ul;

actRIIBgRNA 30ng/ul;

alk4 gRNA 30ng/ul;

Phenol-red 0.2ul;

DEPC Water up to 2ul;

将上述溶液配好混匀后,显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中,养殖24小时后检测actRIIB和alk4基因的突变效率。

7.如权利要求3所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法,其特征在于,所述第五步F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定包括:(1)经过显微注射后斑马鱼受精卵,养殖3个月至性成熟后,与野生型个体杂交获得杂交F1代,F1代个体养殖2个月后,剪取部分尾鳍组织,提取基因组DNA,分别以F-actRIIB/R-actRIIBB为引物检测actRIIB基因的突变效率;

(2)以F-alk4/R-alk4为引物检测alk4基因的突变效率;

(3)利用KOD PLUS高保真酶进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体后转化感受态大肠杆菌,分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA,然后质粒DNA测序比对后筛选获得actRIIB基因和alk4基因均突变的F1代个体。