EGFP‑KI

1.一种基因敲入选育斑马鱼vmhc 品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：CRISPR/Cas9技术vmhc基因靶位点gRNA的设计与合成，通过NCBI和Ensembl在线软件，在斑马鱼vmhc基因最后一个外显子终止密码子处设计一个独特的靶位点，引物序列如下所示：F：TGTAATACGACTCACTATAGGTCAAGAGTAAAGCTCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC、R：AAGCACCGACTCGGTGCCACT；

步骤2：斑马鱼vmhc基因靶位点gRNA有效性检测，按照以下步骤完成：（1）将Cas9 蛋白和gRNA组成预混体系，进行胚胎显微注射；

（2）随机挑选部分注射胚胎，利用PCR和Sanger测序检测靶位点有效性；

步骤3：重组质粒pvmhc‑Left‑2A‑EGFP‑vmhc‑Right的构建，按照以下步骤完成：（1）斑马鱼vmhc基因左右同源臂的选择与合成，利用引物对vmhc‑Left‑F：ggtcgaccactcccaggtatgctaaatgttt和vmhc‑Left‑R：gggatccgactcttgatcatgtcccttctgta合成左同源臂vmhc‑Left，左同源臂位于靶位点上游；利用引物对vmhc‑Right‑F：ggcggccgctgtgtctccgttatgctgaatt和vmhc‑Right‑R：gctcgagtttggccgttatagtccagaaac合成右同源臂vmhc‑Right，右同源臂位于靶位点下游；

（2）纯化回收得到的左同源臂vmhc‑Left与经Sal1和BamH1双酶切pMCS1‑P2A‑EGFP‑MCS2后纯化回收的Sal1‑BamH1‑P2A‑EGFP‑MCS2连接得到pvmhc‑Left‑P2A‑EGFP‑MCS2；

（3）纯化回收得到的右同源臂vmhc‑Right与经Not1和Xho1双酶切pvmhc‑Left‑P2A‑EGFP‑MCS2后纯化回收的vmhc‑Left‑P2A‑EGFP‑Not1‑Xho1连接，即得到重组质粒pvmhc‑Left‑P2A‑EGFP‑vmhc‑Right；

步骤4：将Cas9 蛋白、gRNA及重组质粒组成预混体系，进行胚胎显微注射；

步骤5：在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。

EGFP‑KI

2.根据权利要求1所述的一种基因敲入选育斑马鱼vmhc 品系的方法，其特征在于：步骤2中显微注射及靶位点有效性检测是利用独特靶位点上下游特异性检测引物进行PCR扩增后，通过Sanger测序对靶序列有效性进行检测来确定所设计合成的独特靶位点是有效的。

EGFP‑KI

3. 根据权利要求1所述的一种基因敲入选育斑马鱼vmhc 品系的方法，其特征在于：步骤4中Cas9 蛋白、gRNA及重组质粒组成预混体系，其中Cas9 蛋白的浓度为 5μg/μL，gRNA 的终浓度在50‑60 ng/μL之间，重组质粒浓度在300‑400 ng/μL。

EGFP‑KI

4.根据权利要求1所述的一种基因敲入选育斑马鱼vmhc 品系的方法，其特征在于：步骤5中在荧光显微镜下观察斑马鱼胚胎心室中是否有绿色荧光蛋白表达，确定斑马鱼EGFP‑KIvmhc 品系的成功构建。