1.一种用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统,其特征在于:该基因编辑系统为采用生物矿化纳米材料作为基础载体搭载CRISPR/Cas9质粒系统;
所述生物矿化纳米材料,按体积份数计包括如下组分:
碳酸盐1份,
可溶性钙盐2~5份,
高分子包被材料0.5份,
缓冲液18~20份;其中,
所述碳酸盐为Na2CO3或K2CO3;
所述可溶性钙盐为CaCl2;
所述高分子包被材料为PVP或PAA;
所述缓冲液不含碳酸根;
所述碳酸盐的浓度为40~200mM;
所述可溶性钙盐的浓度为180~460mM;
所述高分子包被材料的浓度为1M;
所述缓冲液的pH=8.0,其含有50 mM Tris‑HCl、300mM NaCl和20%的甘油;
该基因编辑系统具体的搭载及矿化过程包括如下步骤:
1)质粒准备:将设计的CRISPR/Cas9质粒系统与鱼精蛋白共孵育,形成待被搭载的目标质粒;所述CRISPR/Cas9质粒系统为CRISPR变体无PAM限制基因编辑系统,其用于破坏Dys基因的51号外显子;该CRISPR/Cas9质粒系统的靶序列为SEQ51‑1~SEQ51‑4中的任意一种:SEQ51‑1:CACCAGAGCTAACACTCTGAGTAG,SEQ51‑2:TCACCAGAGCTAACACTCTGAGTA,SEQ51‑3:GTGGTCTCATTGTCAGACTCATC,SEQ51‑4:AGTGGTCTCATTGTCAGACTCAT;
2)搭载矿化:将准备好的目标质粒与碳酸盐溶液混合均匀后再加入到缓冲液中混合均匀,然后加入可溶性钙盐,并进行快速涡旋混合,得到搭载目标质粒的矿化纳米颗粒悬浮液;
3)细胞跨膜肽吸附:搭载矿化后,将细胞跨膜肽溶液逐滴滴加至得到的矿化纳米颗粒悬浮液中,并于室温下磁力搅拌10min,以将细胞跨膜肽吸附于矿化纳米颗粒的表面,然后进行高分子包被;所述细胞跨膜肽为来源于HIV病毒的细胞跨膜肽TAT,其序列为RKKRRQRRR;
4)高分子包被:向得到的矿化纳米颗粒悬浮液中加入高分子包被材料,并静置使高分子材料包被在矿化的纳米颗粒上;
5)离心沉淀:将高分子包被后的矿化纳米颗粒悬浮液进行离心,获得搭载目标质粒的矿化纳米颗粒沉淀物;
6)分散重悬:将离心得到的搭载了目标质粒的矿化纳米颗粒沉淀物用DMEM或超纯水分散重悬,获得所需浓度的生物矿化纳米颗粒重悬液以用于基因编辑或用于制备预防及治疗杜氏肌营养不良症的药物。
2.根据权利要求1所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统,其特征在于:步骤1)中,所述CRISPR/Cas9质粒系统与鱼精蛋白共孵育,鱼精蛋白的用量与CRISPR/Cas9质粒系统的质量比为:鱼精蛋白:CRISPR/Cas9质粒系统=1:1~1:5;共孵育的条件为室温温度下共孵育20~40min。
3.根据权利要求1所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统,其特征在于:步骤2)中,所述快速涡旋混合的搅拌速度为500~2000rpm/min,混合时间为30s~1min。
4.根据权利要求1所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统,其特征在于:步骤4)中,所述高分子包被的静置时间为30min,包被后的矿化的纳米颗粒形貌为直径100~
120nm的圆球状;步骤5)中,所述离心沉淀的离心速率为8000~10000rpm,离心时间为
10min。
5.根据权利要求1所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统,其特征在于:步骤3)中,所述细胞跨膜肽溶液浓度为10μg/μL。
6.根据权利要求1所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统,其特征在于:步骤6)中,所述基因编辑包括细胞内基因编辑和生物体内基因编辑;
所述细胞内基因编辑具体为:将制备的生物矿化纳米颗粒用DMEM重悬获得浓度为0.1~10mg/mL的生物矿化纳米颗粒重悬液,然后以与细胞培养基体积比1:5~1:10的比例直接加入到细胞培养皿中,进行细胞培养48小时后,提取细胞的基因组进行检测其基因突变情况;
所述生物体内基因编辑具体为:将制备的用DMEM重悬获得的浓度为50~100mg/μL的生物矿化纳米颗粒重悬液,通过肌肉注射或静脉注射的方式注射在小鼠体内;其中肌肉注射为每天2针,每次100μL,持续注射三天后,提取小鼠肌肉组织的基因组进行检测其基因突变情况。