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专利号: 2021111655810
申请人: 新乡医学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-08
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术将特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA表达载体敲入进入小鼠Rosa26位点,获得sgGfi1基因敲入小鼠;

(2)将sgGfi1基因敲入小鼠与表达Cas9的小鼠进行杂交,获得中性粒细胞缺失的小鼠模型。

2.如权利要求1所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法,其特征在于,步骤(1)中,所述sgGfi1基因敲入小鼠采用以下方法构建:

1)针对小鼠Rosa26基因位点设计2个靶序列,分别为Rosa26‑sgRNA1、Rosa26‑sgRNA2;

2)通过体外转录获得Cas9 mRNA和Rosa26‑sgRNA1/2;

3)合成重组模板DNA:设计重组模板DNA序列,包含以下元件:5‘和3’同源臂、特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA串联表达单元序列U6‑Guide 1‑sgRNA scaffold‑pT‑U6‑Guide2‑sgRNA scaffold‑pT,所述重组模板DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;其中针对gfi1基因的打靶位点序列为:Guide 1:GTACTGACAGGGATAGGGCC GGG,如SEQ ID NO:4所示;Guide 

2:CCAGGTTTAGCTCACCTGTG TGG,如SEQ ID NO:5所示;

4)获得R26‑sgGfi1基因敲入Founder小鼠:将Cas9 mRNA、Rosa26‑sgRNA1/2和重组模板DNA混合,然后通过显微注射操作系统将其注射入小鼠受精卵细胞中,进一步将存活的受精卵细胞移植入假孕ICR小鼠雌鼠输卵管,获得Founder小鼠;

5)对Founder小鼠进行基因型检测,筛选出基因组中sgGfi1序列插入而且插入位点正确的小鼠个体,获得R26‑sgGfi1基因敲入小鼠模型。

3.如权利要求2所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法,其特征在于,步骤1)中,Rosa26‑sgRNA1的核苷酸序列为:5‘‑CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT GGG‑3’,如SEQ ID NO:1所示;

Rosa26‑sgRNA2的核苷酸序列为:5‘‑CGCCCATCTTCTAGAAAGAC TGG‑3’,如SEQ ID NO:2所示。

4.如权利要求2或3所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法,其特征在于,步骤5)采用以下步骤:

A.将获得的Founder小鼠抽提基因组DNA;

B.以获取的基因组DNA为模板,使用特异性引物进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测,筛选出在小鼠Rosa26位点正确插入了sgRNA串联表达单元的小鼠;

C.将sgRNA串联表达单元插入而且插入位点正确的小鼠挑选出来,进行测序验证,挑选出插入目标序列正确的个体,即为R26‑sgGfi1基因敲入小鼠。

5.如权利要求4所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法,其特征在于,步骤B中,先进行第一PCR扩增,初步筛选目标sgRNA串联表达单元序列在基因组中插入的小鼠,然后分别使用引物针对5‘同源臂、3’同源臂和sgRNA串联表达单元部分进行第二PCR扩增,筛选出sgRNA串联表达单元序列插入而且插入位点正确的小鼠。

6.如权利要求5所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法,其特征在于,第一PCR扩增所使用的引物为引物527、引物528和引物680,核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:

10和SEQ ID NO:11所示。

7.如权利要求6所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法,其特征在于,PCR反应体系如下:3条引物各0.2μL,2×Taq Master Mix 5μL,基因组DNA 1μL,补充H2O至总体积10μL;

PCR反应程序如下:95℃ 5min;94℃ 30sec,60℃ 30sec,72℃ 40sec,35个循环;72℃ 

10min。

8.如权利要求5所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法,其特征在于,针对5’同源臂的引物为引物529和引物718,核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示;针对

3’同源臂的引物为引物681和引物727,核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示;针对sgRNA串联表达单元部分的引物为引物679和引物682,核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示。

9.如权利要求8所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法,其特征在于,PCR体系如下:引物各0.2μL,2×Taq Master Mix 5μL,基因组DNA 1μL,补充H2O至总体积10μL;PCR反应程序如下:95℃ 5min;94℃ 30sec,60℃ 30sec,72℃ 70sec,35个循环;72℃ 10min。

10.如权利要求1~3中任一项所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法,其特征在于,使用毛细管电泳,对中性粒细胞缺失的小鼠模型不同组织和器官的gfi1打靶位点进行切割检测,其中用于PCR扩增的特异性引物序列为:F‑TGAAGGAGCGGCACATTTCT,如SEQ ID NO:6所示;R‑GCACAGCTGTTGACATAGAGGA,如SEQ ID NO:7所示。