1.一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法,其特征在于,先通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对Ly6G基因位点进行编辑,获得Ly6G‑DTR基因敲入小鼠模型;
再对Ly6G‑DTR基因敲入小鼠注射白喉毒素,获得经白喉毒素诱导的中性粒细胞100%特异性剔除的小鼠模型;所述Ly6G‑DTR基因敲入小鼠模型的构建,具体包括以下步骤:
1)确定打靶序列:针对Ly6G基因2个靶序列分别为:
Ly6G‑sgRNA1:5‘‑ TCTGCAGAAGGACTGAAACC AGG ‑3’Ly6G‑sgRNA2:5‘‑ CAAGGATGAAGGTCATTGAA TGG ‑3’
2)通过体外转录获得Cas9 mRNA和sgRNA1/2;
3)通过生物合成获得重组模板DNA:设计重组模板DNA序列,包含以下元件:5‘和3’同源臂、T2A连接序列、DTR序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
4)获得Ly6G‑DTR基因敲入Founder小鼠:将Cas9 mRNA、sgRNA1/2和重组模板DNA按一定比例混合,然后通过显微注射操作系统将其注射入小鼠受精卵细胞中,进一步将存活的受精卵细胞移植入假孕ICR小鼠雌鼠输卵管,获得Founder小鼠;
5)对Founder小鼠进行基因型检测,筛选出基因组中DTR序列插入而且插入位点正确的小鼠个体,获得Ly6G‑DTR基因敲入小鼠模型;
通过间隔2‑3天以低剂量腹腔注射白喉毒素的方式,获得经白喉毒素诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤5)具体包括如下步骤:
A.将获得的Founder小鼠抽提基因组DNA;
B.以获取的基因组DNA为模板,使用DTR特异性引物进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测,初步筛选出目标DTR序列在基因组中有插入的小鼠;
C.将具有目标DTR序列扩增条带的样本挑选出来,再分别使用针对左侧同源臂和针对右侧同源臂的引物进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测,筛选出DTR序列在基因组中插入位置正确的小鼠;
D.将DTR序列插入而且插入位点正确的小鼠挑选出来,将以上3段PCR产物分别测序,挑选出插入目标序列正确的个体,即为Ly6G‑DTR基因敲入小鼠。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤B中DTR特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,PCR反应体系如下:F和R引物各 0.2 μL,2×Taq Master Mix 5μL,基因组DNA 1μL,补充H2O至总体积10 μL;PCR反应程序如下:预变性95℃ 5min;变性94℃ 30sec,退火60℃ 30sec,延伸72℃ 40sec,35个循环;终止反应72℃ 10min;将PCR产物进行凝胶电泳检测,若有516 bp的扩增条带,表明DTR序列在基因组中插入。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤C中针对左侧同源臂的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示;针对右侧同源臂的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,PCR体系如下:F和R引物各 0.2 μL,2×Taq Master Mix 5μL,基因组DNA 1μL,补充H2O至总体积10 μL;PCR反应程序如下:预变性95℃
5min;变性94℃ 30sec,退火60℃ 30sec,延伸72℃ 90sec,35个循环;终止反应72℃
10min;将PCR产物进行凝胶电泳检测,若针对左侧同源臂引物有1428 bp 的扩增条带且针对右侧同源臂引物有1081 bp 的扩增条带,表明DTR序列插入而且插入位点正确。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述低剂量为20 ng/g体重。