利索能及
我要发布
收藏
专利号: 2022101836157
申请人: 五邑大学
专利类型:发明专利
专利状态:授权未缴费
更新日期:2024-10-09
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA,其特征在于,所述sgRNA在人ARHGAP11B基因的靶向位点位于人ARHGAP11B基因的6号外显子上;所述sgRNA对应的核苷酸序列为以下情况的至少一种:

a)sgRNA1:

gcgtgtaccagactttatcc;

b)sgRNA2:

ggaaaagataccagccatgt;

c)sgRNA3:

gactttatcctggaaaagat。

2.一种CRISPR/Cas9载体,其特征在于,所述CRISPR/Cas9载体包括权利要求1所述的用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA。

3.如权利要求2所述的CRISPR/Cas9载体,其特征在于,所述CRISPR/Cas9载体由质粒px458‑exon6和质粒pCEP4‑middle酶切后,带入权利要求1所述的用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA、抗性基因Puro和GFP荧光蛋白基因。

4.一种宿主细胞,其特征在于,包括权利要求2或3所述的CRISPR/Cas9载体。

5.一种基于CRISPR/Cas9系统敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:

S1、将权利要求2或3所述的CRISPR/Cas9载体转染iPSC,培养,通过嘌呤霉素筛选成功转染的阳性iPSC;

S2、对成功转染的阳性iPSC进行多能性鉴定。

6.如权利要求5所述的构建方法,其特征在于,所述步骤S1中转染为采用BEX CUY2 EDITⅡ转染系统的电转。

7.如权利要求5所述的构建方法,其特征在于,步骤S1转染结束后,将iPSC加入到含TM

10%CloneRTM的mTeSR 1培养基中进行培养。

8.如权利要求5所述的构建方法,其特征在于,所述构建方法还包括对阳性iPSC进行PCR鉴定的步骤,PCR鉴定中的引物如SEQ ID NO:5~6所示。

9.如权利要求5~8任一项所述的构建方法获得的iPSC细胞系。

10.如权利要求9所述的iPSC细胞系在建立ARHGAP11B基因敲除的体外细胞模型中的应用。