1.一种双酶偶联合成(S)‑香茅醇的方法,其特征在于所述方法为:以含醇脱氢酶YsADH基因的工程菌和含老黄酶NemR‑PS基因的工程菌各自经发酵培养获得的湿菌体混合后作为+催化剂,以橙花醇为底物,以NADP 为辅酶,以pH 6‑9缓冲液为反应介质构成反应体系,在
25‑55℃、0‑900 rpm条件下反应完全后,反应液分离纯化,最终获得(S)‑香茅醇;
所述醇脱氢酶YsADH基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示;老黄酶NemR‑PS基因核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示;
所述含醇脱氢酶YsADH基因的工程菌按如下方法构建:将醇脱氢酶YsADH编码基因插入pET28b载体的Nco I和Hind III限制性酶切位点,得到重组载体pET28b‑YsADH;将重组载体pET28b‑YsADH导入宿主细胞E. coli BL21(DE3),得到基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28b‑YsADH;
所述含老黄酶NemR‑PS基因的工程菌按如下方法构建:将老黄酶NemR‑PS编码基因插入pET28b载体的Nco I和Xho I限制性酶切位点,得到重组载体pET28b‑NemR‑PS;将重组载体pET28b‑NemR‑PS导入宿主细胞E. coli BL21(DE3),得到基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28b‑NemR‑PS。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述含醇脱氢酶YsADH基因工程菌的湿菌体与含老黄酶NemR‑PS基因工程菌的湿菌体以质量比0.25‑4:1混合,所述催化剂加入量以湿菌体总量计为120 g/L。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述底物以1 M橙花醇乙醇溶液形式加入,所述橙花醇加入终浓度为10‑100 mM;所述辅酶加入终浓度0.6mM。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述缓冲液为pH 7.5的50 mM Tris‑HCl缓冲液。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述含醇脱氢酶YsADH基因工程菌的湿菌体按如下方法制备:将含醇脱氢酶YsADH基因的工程菌接种于含有终浓度100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,在37℃和200 rpm下培养过夜,然后以体积浓度2%的接种量转接于含有
100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,在37℃和200 rpm培养至菌体浓度OD600至0.6~
0.8,向培养物中加入终浓度0.2 mM的IPTG,在21℃下诱导培养12 h,获得诱导培养液;再将诱导培养液于4℃和8000 rpm下离心10 min,弃去上清液;然后用pH 8.0、50 mM Tris‑HCl缓冲液重悬菌体,于4℃和8000 rpm下离心10 min,弃去上清液,收集湿菌体。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述含老黄酶NemR‑PS基因工程菌的湿菌体按如下方法制备:将含老黄酶NemR‑PS基因的工程菌接种于含有终浓度100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,在37℃和200 rpm下培养过夜,以体积浓度2%的接种量转接于终浓度100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,在37℃和200 rpm培养至菌体浓度OD600至0.6~0.8,向培养物中加入终浓度0.2 mM的IPTG,在24℃下诱导培养12 h,获得诱导培养液;再将诱导培养液于4℃和8000 rpm下离心10 min,弃去上清液;然后用pH 8.0、50 mM Tris‑HCl缓冲液重悬菌体,于4℃和8000 rpm下离心10 min,弃去上清液,收集湿菌体。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述反应液分离纯化方法为:反应液在12000 rpm下离心2 min,取上清,加入4倍反应液体积的乙酸乙酯,在200 rpm和30℃条件下萃取1 h,萃取结束后,在12000 rpm下离心1 min,取上层有机相,经减压蒸馏去除乙酸乙酯,最终获得(S)‑香茅醇。