1.一种三酶共表达重组菌,其特征在于所述共表达重组菌是将老黄酶NemR‑PS编码基因、醇脱氢酶YsADH编码基因和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因共同导入宿主细胞构建而成;
所述老黄酶NemR‑PS编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,醇脱氢酶YsADH编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.如权利要求1所述三酶共表达重组菌,其特征在于所述共表达重组菌按如下方法构建:将所述醇脱氢酶YsADH编码基因插入pACYCDuet‑1载体上的第一克隆位点Nco I和Hind III之间,将所述老黄酶NemR‑PS编码基因插入pACYCDUet‑1载体上的第二克隆位点Nde I和Xho I之间,得到第一重组载体pACYCDuet‑1‑YsADH‑NemR‑PS;将所述葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因插入载体pET28b上的EcoR I和Hind III之间,得到第二重组载体pET28b‑BmGDHM6;
将第一重组载体pACYCDuet‑1‑YsADH‑NemR‑PS导入宿主细胞E.coli BL21(DE3),得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet‑1‑YsADH‑NemR‑PS;然后将第二重组载体pET28b‑BmGDHM6导入重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet‑1‑YsADH‑NemR‑PS感受态细胞中,得到所述的共表达重组菌。
3.一种权利要求1所述三酶共表达重组菌在还原(E/Z)‑柠檬醛合成(S)‑香茅醇中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述应用为:以共表达重组菌经诱导表达获得的湿菌体为催化剂,以(E/Z)‑柠檬醛为底物,以葡萄糖为辅底物,加入助溶剂和/或辅酶+NADP ,以pH 5.0~9.0的缓冲液为反应介质构成转化体系,在20~45℃、0~700rpm条件下转化反应12~48h,获得含(S)‑香茅醇的反应液,反应液分离纯化,获得(S)‑香茅醇;所述助溶剂为1‑丁醇、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇或二甲基亚砜。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述转化体系中,催化剂加入量以转化体系体积计为10~100g/L;底物加入终浓度以转化体系体积计为50~400mM;所述葡萄糖加入终浓+度为底物加入浓度的3倍;所述NADP 加入终浓度以转化体系体积计为0~1.0mM;所述助溶剂体积加入量以转化体系体积计为10~40%。
6.如权利要求4所述的应用,其特征在于在反应过程中,补加含葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因的工程菌诱导培养的湿菌体。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于湿菌体的补加量以转化体系体积计为20~
80g/L,补加的时间点为反应进程的12h、24h或者36h。
8.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述共表达重组菌的湿菌体按如下方法制备:
将共表达重组菌接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,在37℃和200rpm下培养过夜,然后培养液以体积浓度2%的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6~0.8,向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG,在23℃下诱导培养12h,获得诱导培养液;再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min,弃去上清液;然后用pH8.0、50mM Tris‑HCl缓冲液重悬菌体,于4℃和8000rpm下离心10min,弃去上清液,收集湿菌体。
9.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述含葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因的工程菌诱导培养的湿菌体按如下方法制备:将含葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因的工程菌接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,在37℃和200rpm下培养过夜,然后培养液以体积浓度2%的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,在37℃和
200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6~0.8,向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG,在23℃下诱导培养12h,获得诱导培养液;再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min,弃去上清液;
然后用pH8.0、50mM Tris‑HCl缓冲液重悬菌体,于4℃和8000rpm下离心10min,弃去上清液,收集湿菌体。
10.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述反应液分离纯化方法为:反应液在
12000rpm下离心2min,取上清,加入4倍反应液体积的乙酸乙酯,在200rpm和30℃条件下萃取1.5h,萃取结束后,在12000rpm下离心1min,取上层有机相;在有机相中加入无水硫酸钠去除水分后,减压蒸馏去除溶剂乙酸乙酯,得到产物(S)‑香茅醇。