1.一种分离并鉴定植物乳杆菌来源的抑制双菌生物膜的物质的方法,其特征在于,所述抑制双菌生物膜是指抑制变异链球菌和白色念珠菌互作形成的生物膜,包括以下步骤:步骤(1):利用乙酸乙酯萃取植物乳杆菌发酵液
发酵培养植物乳杆菌CCFM8724,收集发酵液,利用乙酸乙酯萃取多次,分别收集萃余相、萃取相,将萃取相浓缩得到乙酸乙酯萃取浸膏并用LC‑MS检测乙酸乙酯萃取浸膏中的成分;
步骤(2):利用硅胶柱层析和TLC对乙酸乙酯萃取浸膏中的成分进行分离、检测利用硅胶柱层析对乙酸乙酯萃取浸膏中的成分进行分离纯化,以氯仿、甲醇混合物作为洗脱剂,将洗脱物浓缩后利用TLC检测并合同相同组分、浓缩干燥;所述氯仿、甲醇混合物中氯仿、甲醇的体积比是95:5、90:10、85:15、80:20、70:30、60:40或50:50;
步骤(3):检测步骤(2)所得各成分抑制生物膜成膜的效果
将变异链球菌、白色念珠菌的菌悬液混合,随后分别加入步骤(2)浓缩干燥得到的各成分,静置培养一段时间,检测生物膜的成膜情况,选择与阴性对照相比具有显著抑制效果的成分,利用GC‑MS进行鉴定;
步骤(4):GC‑MS鉴定其物质组成
将步骤(3)所得具有显著抑制效果的成分进行衍生化,并将经过衍生化处理、没有经过衍生化处理的成分分别利用GC‑MS进行分析;所述衍生化是取步骤(2)中得到的干燥样品加o入100 μL的0.1 mg/mL甲氧胺盐酸吡啶溶液,涡旋震荡30 s,于37 C干式恒温金属浴90 omin,然后加入40 μL的含1% TMCS的MSTFA试剂,于37C金属浴30 min,离心,吸取100 μL上清液至内衬管中,进行GC‑MS鉴定;所述没有经过衍生化处理,是取步骤(2)中的干燥样品加入100 μL的乙醇,转移至内衬管中,进行GC‑MS鉴定;
GC‑MS的程序为:扫描的质量数范围为 40–450 m/z,离子源类型为 EI 源,程序升温:o o o
起始温度为150C,保持1 min,以10 C/min的升温速率提高至180 C,保持4 min,然后以o o
15C/min的升温速率提高至300C,在此条件下维持17 min;载气为氦气,流速 1 mL/min;电子电离能量:70 eV;色谱柱为 RTX‑5MS,30 m × 0.25 mm × 0.25μm;
步骤(5):数据处理
将GC‑MS分析所得原始数据文件进行峰提取、保留时间校正、峰对齐处理,得到代谢物的质谱信息、峰面积和保留时间在内的相关数据矩阵,将这些数据矩阵与数据库中的数据进行匹配,得到相应的化合物的结构信息。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,利用乙酸乙酯萃取3次。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,浓缩采用旋转蒸发。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,在96 孔板中分别加入变异链球菌、白色念珠菌菌悬液各75 μL,随后分别加入50 μL步骤(2)所得各成分,于37 ℃静置培养24 h。