1.一种D‑泛解酸生产菌,由如下方法构建获得:(1)以E.coli DPAL4为底盘菌,将其基因组中的panC基因敲除,得到重组菌株DPAL4 ΔpanC;
(2)将外源基因panB整合入质粒pTrc99A中,得到质粒pTrc99A‑panB;将质粒pTrc99A‑panB导入步骤(1)所述重组菌中,得到所述D‑泛解酸生产菌。
2.如权利要求1所述的D‑泛解酸生产菌,其特征在于所述E.coli DPAL4按如下方法构建获得:
(1)以菌株CCTCC NO:M 2018914为底盘菌株,将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子,得到DPA9 Trc‑lpd,记为DPA10;
(2)将DPA9 Trc‑lpd基因组中的glk基因敲除,得到DPA9 Trc‑lpd/△glk,记为DPA11;
(3)将带有M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中,得到菌株DPA11/M13‑ilvA,记为DPAL1;
(4)将DPAL1基因组中的pck基因启动子替换为Trc启动子,得到菌株DPAL1/Trc‑pck,记为DPAL2;
(5)将DPAL2基因组中的maeB基因启动子替换为Trc启动子,得到菌株DPAL2/Trc‑maeB,记为DPAL3;
(6)将DPAL3基因组中的ilvBN操纵子启动子替换为Trc启动子,得到菌株DPAL3/Trc‑ilvBN,记为DPAL4。
3.构建权利要求1所述D‑泛解酸生产菌的方法,其特征在于所述方法如下:(1)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将底盘菌E.coli DPAL4基因组中的panC基因敲除,得到重组菌株DPAL4 ΔpanC;
(2)将外源基因panB整合入质粒pTrc99A中,得到质粒pTrc99A‑panB;将质粒pTrc99A‑panB导入步骤(1)所述重组菌中,得到所述D‑泛解酸生产菌。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于所述底盘菌E.coli DPAL4由如下方法构建获得:
(1)以菌株CCTCC NO:M 2018914为底盘菌株,运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子,得到DPA9 Trc‑lpd,记为DPA10;
(2)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将DPA9 Trc‑lpd基因组中的glk基因敲除,得到DPA9 Trc‑lpd/△glk,记为DPA11;
(3)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将带M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中,得到重组菌株DPAL1;
(4)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将DPAL1基因组中pck基因的启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株DPAL2;
(5)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将DPAL2基因组中maeB基因的启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株DPAL3;
(6)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将DPAL3基因组中ilvBN操纵子的启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株DPAL4。
5.权利要求1所述D‑泛解酸生产菌在微生物发酵制备D‑泛解酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述应用为:将所述D‑泛解酸生产菌接种至发酵培养基中,于28~32℃、200~500rpm条件下进行发酵培养24~48h,发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到备D‑泛解酸;所述发酵培养基组成如下:葡萄糖10~30g/L、硫酸铵10~
20g/L、酵母浸粉1~5g/L、KH2PO4 1~5g/L、MgSO4 0.1~2.0g/L、微量金属盐溶液0.5~5mL/L,pH 6.5~7.0,溶剂为去离子水;微量金属盐溶液组成为:10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·
7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O,溶剂为去离子水。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述发酵培养基组成如下:葡萄糖20g/L,硫酸铵16g/L,酵母粉2g/L,KH2PO4 2g/L,MgSO4 0.5g/L,盐溶液2mL/L,溶剂为去离子水。