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专利号: 2021106274838
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种D‑泛酸生产菌,由如下方法构建获得:

(1)以菌株CCTCC NO:M 2018914为底盘菌株,将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子,得到DPA9 Trc‑lpd,记为DPA10;

(2)将DPA9 Trc‑lpd基因组中的glk基因敲除,得到DPA9 Trc‑lpd/△glk,记为DPA11;

(3)将带有M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中,得到菌株DPA11/M13‑ilvA,记为DPA11A;

(4)将菌株DPA11A基因组中内源基因pckA、maeB和ilvBN的原始启动子替换为Trc启动子,得到菌株ZJUTDPAL3;

(5)将外源基因panB、panC、alsS和内源基因ilvD同时整合入质粒pTrc99A中,得到质粒pTrc99A‑panB/panC/alsS/ilvD,将该质粒导入菌株ZJUTDPAL3中,得到菌株ZJUTDPAL4;所述外源基因panB来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum),panC来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum),alsS来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);

(6)将菌株ZJUTDPAL4基因组中gdhA基因的起始密码子ATG突变为TTG,得到菌株ZJUTDPAL5;

(7)将菌株ZJUTDPAL5基因组中pta基因敲弱,得到菌株ZJUTDPAL6;

(8)将菌株ZJUTDPAL6基因组中cycA基因的原始启动子替换成Trc启动子,得到菌株ZJUTDPAL7,即所述D‑泛酸生产菌。

2.构建权利要求1所述D‑泛酸生产菌的方法,其特征在于所述方法如下:

(1)以菌株CCTCC NO:M 2018914为底盘菌株,运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子,得到DPA9 Trc‑lpd,记为DPA10;

(2)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将DPA9 Trc‑lpd基因组中的glk基因敲除,得到DPA9 Trc‑lpd/△glk,记为DPA11;

(3)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将带M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中,得到重组菌株DPA11A;

(4)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将DPA11A基因组中内源基因pckA、maeB和ilvBN的原始启动子替换为Trc启动子,得到菌株ZJUTDPAL3;

(5)将外源基因panB、panC、alsS和内源基因ilvD同时整合入质粒pTrc99A中,得到质粒pTrc99A‑panB/panC/alsS/ilvD;将该质粒导入菌株ZJUTDPAL3中,得到菌株ZJUTDPAL4;所述外源基因panB来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum),panC来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum),alsS来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);

(6)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株ZJUTDPAL4基因组中gdhA基因的起始密码子ATG突变为TTG,得到菌株ZJUTDPAL5;

(7)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株ZJUTDPAL5基因组中pta基因敲除,得到菌株ZJUTDPAL6;

(8)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株ZJUTDPAL6基因组中cycA基因启动子替换为Trc启动子,得到菌株ZJUTDPAL7,即所述D‑泛酸生产菌。

3.权利要求1所述D‑泛酸生产菌在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述应用为:将所述D‑泛酸生产菌接种至发酵培养基中,于35 40 ℃、100 300 rpm条件下进行发酵培养12 24h,发酵结束后取发酵液上~ ~ ~清分离纯化得到备D‑泛酸;所述发酵培养基组成如下:葡萄糖10 30g/L、硫酸铵10 20g/L、~ ~酵母粉1~5g/L、KH2PO4 0.1~1.0g/L、MgSO4 0.1~2.0g/L、β‑丙氨酸1~5g/L,微量金属盐溶液

0.5~5mL/L,pH 6.5~7.0,溶剂为去离子水;微量金属盐溶液组成为:10 g/L CuCl2、10 g/L FeSO4·7H2O、1 g/L ZnSO4·7H2O、0.20 g/L CuSO4、0.02 g/L NiCl2·7H2O,溶剂为去离子水。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述发酵培养基组成如下:葡萄糖20g/L,硫酸铵16g/L,酵母粉2g/L,KH2PO4 0.8g/L,MgSO4 0.5g/L,β‑丙氨酸2g/L,微量金属盐溶液 2mL/L,溶剂为去离子水。