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专利号: 2021102898743
申请人: 南京师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-08-18
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种生物传感器检测转录因子NF‑κB p50的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:(a)将Cas12a、crRNA、NE缓冲液进行混合,然后加入荧光报告基因并在冰浴下混合以制备CRISPR报告组合CRM混合液;

(b)将带有PAM结构域的双链DNA作为激活序列,和反应缓冲液进行混合,再加入测试样品,孵育;

(c)将ExoIII核酸外切酶及(b)中所述的反应缓冲液添加到(b)所得的溶液中,孵育;

(d)将(a)中配制的CRM混合液加入(c)中所得的最终溶液中,孵育,再在60‑70℃下灭活;

(e)将(d)中所得的最终溶液在读板仪上进行快速和高通量检测,在450‑570nm之间进行激发和发射;

(f)将(d)中所得的最终溶液用荧光光谱仪测量荧光;

(g)重复上述步骤,检测不同浓度的测试样品的荧光值,通过绘制关系图,计算NF‑κB p50浓度与荧光强度之间的关系;

(h)将待测样品作为测试样品,进行步骤(a)‑(f),将测得的荧光值与步骤(g)获得的关系图进行对比,计算待测样品中NF‑κB p50的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(a)中Cas12a浓度为40‑80nM。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(a)中crRNA浓度为450‑600nM。

4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(a)所述的crRNA的序列为:斜体字母表示与激活序列结合的区域。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(b)所述的带有PAM结构域的双链DNA的序列为:

斜体字母表示crRNA识别序列,有下划线的字母表示PAM结构域;加粗字母表示与NF‑κB结合的区域。

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(b)中反应缓冲液为含有Na2HPO4/NaH2PO4、CH3COONa、Mg(CH3COOH)2、glycerol、poly(dI‑dC)的溶液,pH 7‑8。

7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(b)中激活序列的浓度为30‑60nM。

8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(c)中ExoIII核酸外切酶的浓度为2‑6单位/L。

9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(e)中分别在510nm和566nm处进行激发和发射。

10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(f)中荧光光谱仪在λ=510nm的波长下测量荧光。