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专利号: 2019103661530
申请人: 湖南文理学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)质粒载体的构建,所述质粒载体包括第一载体和第二载体:所述第一载体包括Kop-Cas9-nos3’UTR,所述Kop-Cas9-nos3’UTR的构建包括Kop启动子和nanos1a基因3’端UTR共同使cas9基因特异表达于原始生殖细胞;

所述第二载体为gRNA载体,确定靶序列为:TGGGTTTCCTCCGGGTGCTCCGG,所述靶序列在斑马鱼基因组中为重复序列,其重复100万次以上;

(2)gRNA的获得:

以gRNA-plasmid为模板,以gRNA-F/gRNA-R为引物,gRNA-F:TAATACGACTCACTATAGGGTGGGTTTCCTCCGGGTGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG;gRNA-R:AGCACCGACTCGGTGCCACT;进行PCR扩增,以测序验证序列PCR产物为模板进行体外转录获得gRNA;

(3)显微注射:

将所述Kop-Cas9-nos3’UTR和所述gRNA显微共注射。

2.根据权利要求1所述的特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述Kop-Cas9-nos3’UTR的构建包括如下具体方式:获取基础载体为pkop:KalTA4载体,所述pkop:KalTA4载体的原件为Kop-KalTA4-nos3’UTR;

用DNA限制性内切酶AscI和BspEI将基因KalTA4从所述pkop:KalTA4载体中切除;

获取Cas9基因,设计引物Cas9-F/Cas9-R:Cas9-F:5’-ACGGCGCGCCACCATGGCTTCTCCACCTAAG-3’;

Cas9-R:5’-AGTCCGGATCACACCTTTCTCTTCTTCTTAGG-3’;

以Cas9质粒为模板,利用KOD PLUS高保真酶进行PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶AscI和BspEI酶切后,利用T4DNA连接酶与上述切除KalTA4基因的pkop:KalTA4载体骨架连接,获得Kop-Cas9-nos3’UTR。

3.根据权利要求1所述的特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,gRNA的获得包括如下具体方式:通过所述gRNA-plasmid和所述gRNA-F/gRNA-R,首先利用KOD Plus高保真酶进行PCR扩增,扩增产物割胶回收,回收产物连接pMD18-T载体后转化感受态大肠杆菌;

然后挑取5个所述大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA,所述质粒DNA测序进行序列验证,序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板;

再利用 T7Transcription Kit将构建好的含有靶序列的质粒体外逆转录20ul反应体系如下:

10x Reaction Buffer 2ul;

Plasmid DNA 4ul;

T7 Enzyme 2ul;

10mmol/L NTP 1ul;

DEPC water 11ul;

以上体系37℃反应一个小时后纯化备用。

4.根据权利要求1所述的特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,显微注射系统如下:Kop-Cas9-nos3’UTR 100ng/ul;

gRNA 30ng/ul;

Phenol-red 0.2ul;

DEPC Water up to 2ul;

将上述溶液配好混匀后,显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中,不同时间取样检测原始生殖细胞特异表达基因nanos1基因的表达水平和原始生殖细胞的数量变化。