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专利号: 2020108317299
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-10-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器,其特征在于,包括发夹底物HS1和HS2,甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy5/Cy3‑信号探针‑AuNP纳米结构和核糖核酸酶Nase HII;

所述Cy5/Cy3‑信号探针‑AuNP纳米结构由信号探针SP1、SP2和金纳米颗粒(AuNPs)组成;所述信号探针SP1和SP2在3'端修饰了巯基‑SH,所述信号探针SP1和SP2通过S‑Au共价键连接在金纳米颗粒(AuNPs)的表面上;所述信号探针SP1在位于SP1的5'端下游5个胸腺嘧啶碱基上修饰Cy5荧光团;所述信号探针SP2在位于SP2的5'端下游4个胸腺嘧啶碱基上修饰Cy3荧光团;

所述发夹底物HS1的核苷酸序列为:5'‑GGC TTA CAC GTG TTC TCG ACT CCA TGC TGA ACA CGT GTA AGC C‑3';

所述发夹底物HS2的核苷酸序列为:5'‑GTC TGG TTG CGC AAT AAC TCT ACT ATC AAT TGC GCA ACC AGA C‑3',下划线碱基C分别为修饰的5‑mC;

所述Cy5修饰的信号探针SP1的核苷酸序列为:5'‑AGC ATG GAG TCG ATT‑SH‑3' ,下划线碱基T修饰Cy5;

所述Cy3修饰的信号探针SP2的核苷酸序列为:5'‑TGA TAG TAG AGT TTT‑SH‑3',下划线碱基T修饰Cy3;

所述发夹底物HS1、甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy5‑信号探针‑SP1‑AuNP纳米结构和核糖核酸酶Nase HII是用于检测M.SssI甲基化转移酶;

所述发夹底物HS2、甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy3‑信号探针‑SP2‑AuNP纳米结构和核糖核酸酶Nase HII是用于检测M.CviPI甲基化转移酶。

2.如权利要求1所述的检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器,其特征在于,所述发夹底物HS1和HS2的序列与信号探针SP1和SP2的序列部分互补杂交。

3.如权利要求1所述的检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器,其特征在于,所述发夹底物HS1和HS2为DNA甲基化转移酶的催化底物,发夹底物HS1和HS2甲基化反应后为DNA核酸内切酶GlaI的识别序列。

4.一种检测DNA甲基化转移酶的方法,其特征在于,所述方法以非诊断和非治疗为目的,所述方法包括:采用发夹底物HS1和HS2,甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy5/Cy3‑信号探针‑AuNP纳米结构和核糖核酸酶RNase HII进行循环裂解;

所述Cy5/Cy3‑信号探针‑AuNP纳米结构由信号探针SP1、SP2和金纳米颗粒(AuNPs)组成;所述信号探针SP1和SP2在3'端修饰了巯基‑SH,所述信号探针SP1和SP2通过S‑Au共价键连接在金纳米颗粒(AuNPs)的表面上;所述信号探针SP1在位于SP1的5'端下游5个胸腺嘧啶碱基上修饰Cy5荧光团;所述信号探针SP2在位于SP2的5'端下游4个个胸腺嘧啶碱基上修饰Cy3荧光团;

所述发夹底物HS1的核苷酸序列为:5'‑GGC TTA CAC GTG TTC TCG ACT CCA TGC TGA ACA CGT GTA AGC C‑3';

所述发夹底物HS2的核苷酸序列为:5'‑GTC TGG TTG CGC AAT AAC TCT ACT ATC AAT TGC GCA ACC AGA C‑3',下划线碱基C分别为修饰的5‑mC;

所述Cy5修饰的信号探针SP1的核苷酸序列为:5'‑AGC ATG GAG TCG ATT‑SH‑3' ,下划线碱基T修饰Cy5;

所述Cy3修饰的信号探针SP2的核苷酸序列为:5'‑TGA TAG TAG AGT TTT‑SH‑3',下划线碱基T修饰Cy3;

所述发夹底物HS1、甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy5‑信号探针‑SP1‑AuNP纳米结构和核糖核酸酶Nase HII是用于检测M.SssI甲基化转移酶;

所述发夹底物HS2、甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy3‑信号探针‑SP2‑AuNP纳米结构和核糖核酸酶Nase HII是用于检测M.CviPI甲基化转移酶。

5.如权利要求4所述的检测DNA甲基化转移酶的方法,其特征在于,检测方法具体包括以下步骤:

将发夹底物HS1和HS2添加到待测物的反应溶液中进行孵育;向孵育后的产物中加入甲基介导的核酸内切酶GlaI进行孵育;将孵育后得到的产物加入到含有Cy5/Cy3‑信号探针‑AuNP纳米结构和核糖核酸酶RNase HII的反应溶液中进行温育,以进行RNase HII介导的循环裂解反应;

循环裂解反应释放出大量Cy5和Cy3分子,对释放出的Cy5和Cy3分子进行检测,以测定待测物的活性。

6.如权利要求5所述的检测DNA甲基化转移酶的方法,其特征在于,对释放出的Cy5和Cy3分子进行检测采用的方法为基于全内反射荧光(TIRF)的单分子成像简单地量化计数。

7.一种权利要求1‑3任一权利要求所述的检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器和/或权利要求4‑6任一权利要求所述的检测DNA甲基化转移酶的方法在区分不同的DNA甲基化转移酶、筛选DNA甲基化转移酶抑制剂中的应用。