1.一种酪氨酸磷酸酶生物传感器,其特征是,包括磁珠、肽-DNA偶联物、DNA模板、信号探针;
所述肽-DNA偶联物包括肽链和第一DNA序列,肽链一端连接第一DNA序列的5'端,肽链含有磷酸化的酪氨酸;肽链另一端设置为用于连接磁珠;
所述DNA模板从5'端至3'端由两个第二DNA序列和一个第三DNA序列组成,第三DNA序列与第一DNA序列能够互补,DNA模板与第一DNA序列杂交再聚合后能够形成具有两个切口酶识别位点的双链DNA,第二DNA序列的互补链为脱氧核酶;
所述信号探针为核苷酸序列,所述核苷酸序列的两端分别连接荧光团和猝灭剂,所述核苷酸序列能够与脱氧核酶互补;所述脱氧核酶为在二价阳离子依赖性反应中裂解互补的RNA序列。
2.如权利要求1所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器,其特征是,肽-DNA偶联物通过链霉亲和素与生物素的结合与磁珠连接。
3.如权利要求1所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器,其特征是,所述荧光团为Cy3,所述猝灭剂为BHQ2。
4.如权利要求1所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器,其特征是,肽链和第一DNA序列的连接处与含有磷酸化的酪氨酸之间连接2~4个氨基酸。
5.如权利要求1所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器,其特征是,肽-DNA偶联物的序列为:Lys-Gly-Asp-Gly-Val-pTyr-Ala-Ala-Cys-GGA TCG TCA TGT ACG GCA GCT;
DNA模板的序列为:CAT GAG ATT CGT TGT AGC TAG CCT CAA CCC TCA GCC ATG AGA TTC GTT GTA GCT AGC CTC AAC CCT CAG CTG CCG TAC ATG ACG ATC C;
信号探针的序列为:CAT GAG ATA UTC AAC CCT C。
6.一种酪氨酸磷酸酶的检测方法,其特征是,提供权利要求1~5任一所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器;
将表面连接肽-DNA偶联物的磁珠与含有酪氨酸磷酸酶的溶液进行去磷酸化反应,向去磷酸化反应后的体系中添加胰凝乳蛋白酶进行裂解反应,裂解反应后进行磁分离去除磁珠获得裂解产物,将裂解产物与DNA模板、信号探针在二价阳离子作用下进行三级DNA扩增反应,对三级DNA扩增反应后的溶液体系进行荧光检测。
7.如权利要求6所述的酪氨酸磷酸酶的检测方法,其特征是,磷酸化反应的反应温度为
35~40℃,反应时间为1.5~2.5h;
或,裂解反应的反应温度为35~40℃,反应时间为1.5~2.5h;
或,三级DNA扩增反应的过程为,先使裂解产物与DNA模板形成双链DNA,然后添加DNA聚合酶和切口酶进行链置换扩增反应,向链置换扩增反应后的体系中添加信号探针进行孵育;
优选的,双链DNA的条件为:先在95~100℃下加热4~6分钟,然后冷却至室温;
优选的,链置换扩增反应的条件为:温度为50~60℃,时间为50~70min;
优选的,孵育温度为35~40℃,孵育时间为1.5~2.5h。
8.一种权利要求1~5任一所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器在制备检测酪氨酸磷酸酶试剂中的应用。
9.一种权利要求1~5任一所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器或权利要求6或7所述的酪氨酸磷酸酶的检测方法在筛选酪氨酸磷酸酶抑制剂中的应用。
10.一种酪氨酸磷酸酶检测试剂盒,其特征是,包括权利要求1~5任一所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器、胰凝乳蛋白酶、DNA聚合酶、切口酶、镁盐、缓冲液。