1.一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体,其特征在于:将海洋细菌Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶氨基酸序列进行了如下突变:172位赖氨酸K突变为谷氨酸E,200位谷氨酸E突变为酪氨酸Y,201位丝氨酸S突变为色氨酸W,所述Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰基酶基因密码子优化序列如附录1所示,所述海洋细菌Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶氨基酸序列GenBank收录号为AW19M34-1。
2.根据权利要求1所述的一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体,其特征在于:编码Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的质粒和细胞,其中质粒pET21a(+),用于克隆的感受态细胞:E. coli DH5α;用于表达的感受态细胞:E.coli BL21(DE3)。
4.一种如权利要求1所述的Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制备方法,其特征在于:通过设计引物对编码几丁质脱乙酰酶的基因进行定点突变后表达,具体包括如下步骤:(1)以质粒pET-21a为模板设计引物进行突变;
(2)将突变后的质粒转化进入E. coli DH5α进行扩增;
(3)以E. coli BL21(DE3)表达含突变基因的重组质粒,得到活性增强的几丁质脱乙酰酶突变体;
(4)将含有编码突变几丁质脱乙酰酶的基因的重组菌E.coli BL21(DE3)(pET21a-mut4)活化培养后发酵培养,获取发酵菌;
(5)破碎发酵菌体,离心收集上清液,制备获得Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶的粗酶液;
(6)按照His60 Ni Gravity Column Purification Kit(Takara, Code No. 635658)说明书进一步纯化。
5.根据权利要求4所述的一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制备方法,其特征在于:所述定点突变的引物如下:ES200YW primer F:ACATTCACTATTGGAGCGTGAAGGCGGTTCCGCAGES200YW primer R:TTCACGCTCCAATAGTGAATGTCGTGCATCAGAATGK172E primer F:GTTGACACGCTGGATTGGGAGCACCACGACCCACAAAAGK172E primer R:CTTTTGTGGGTCGTGGTGCTCCCAATCCAGCGTGTCAAC。
6.根据权利要求4所述的一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制备方法,其特征在于:所述发酵培养具体操作为:将含有编码突变几丁质脱乙酰酶的基因的重组菌E.coli BL21(DE3)(pET21a-mut4)活化培养后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中,接种量为1%,于37℃200 r/min培养至OD600为0.6,加入终浓度0.5mM IPTG,
30℃诱导发酵12h,发酵结束后在4℃、12000 r/min条件下冷冻离心5min收集菌体,收集的菌体按照1g菌体用10mL 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)重悬,并以超声波细胞粉碎仪破碎菌体,在4℃、12000r/min条件下冷冻离心5 min,收集上清液作为粗酶液。
7.根据权利要求6所述的一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制备方法,其特征在于:所述超声波细胞粉碎仪共超声5min,每超声5s暂停5s。
8.根据权利要求6所述的一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制备方法,其特征在于:所述氨苄青霉素的发酵培养基组成包括胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L,培养基pH7.0。