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1.一种Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法,其特征在于,先将ApoE 小鼠的Slfn4基因敲除,获得F0代小鼠;再对F0代小鼠进行基因型鉴定选择Slfn4基因敲除的F0–/– –/–代ApoE 背景小鼠,并将其与ApoE 小鼠进行回交获得F1代Slfn4基因杂合子小鼠;最后将F1代Slfn4基因杂合子小鼠进行自交获得F2代小鼠,对F2代小鼠进行基因型鉴定筛选,获得Slfn4双等位基因敲除且ApoE双等位基因敲除的纯合子个体即为Slfn4基因敲除动脉粥样硬化模型小鼠;
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所述F0代小鼠的获得是采用CRISPR/Cas9技术将ApoE 小鼠的Slfn4基因敲除;
所述 F0代小鼠的获得包括以下步骤:
1)靶向小鼠Slfn4基因的sgRNA选择:CRISPR‑Cas9系统中sgRNA作用位点位于Slfn4基因的2号外显子区,sgRNA作用位点DNA靶序列分别如下所示:Slfn4‑sgRNA1:5’‑ AGGTGCAGGATACCAGGCAA GGG‑3’;
Slfn4‑sgRNA2:5’‑ AAGCCGAATCAGAGAGGTCC GGG‑3’;
Slfn4‑sgRNA3:5’‑ CTCAGTTGAACTGAAAGCAG CGG‑3’;
2)引物设计:根据步骤1)获得的sgRNA靶序列设计4条引物,引物序列如下所示:Slfn4‑IVT‑1:5’‑TTCTAATACGACTCACTATAGGAGGTGCAGGATACCAGGCAAGTTTTAGAGCTAGA‑3’;
Slfn4‑IVT‑2:5’‑TTCTAATACGACTCACTATAGGAAGCCGAATCAGAGAGGTCCGTTTTAGAGCTAGA‑3’;
Slfn4‑IVT‑3:5’‑TTCTAATACGACTCACTATAGGCTCAGTTGAACTGAAAGCAGGTTTTAGAGCTAGA‑3’;
Slfn4‑IVT‑4:5’‑AAAAAAGCAC CGACTCGGTG CC‑3’;
3)合成双链DNA片段:将步骤2)中的Slfn4‑IVT‑1、Slfn4‑IVT‑2、Slfn4‑IVT‑3分别与Slfn4‑IVT‑4配对,以pX330质粒为模板,进行聚合酶链式反应并对获得的DNA扩增产物进行纯化;
4)获得sgRNA和Cas9 mRNA:分别以步骤3)中双链DNA片段为模版,体外转录并纯化,获得sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3;以AgeI单酶切线性化的pST1374‑Cas9质粒为模版,体外转录并纯化,获得Cas9 mRNA;
5)获得Slfn4缺失的F0代小鼠:将步骤4)获得的3个sgRNA和Cas9 mRNA等比例注射由–/–ApoE 小鼠精子和C57BL/6小鼠卵细胞体外受精产生的受精卵细胞,获得Slfn4基因敲除的受精卵细胞并其移植至假孕雌鼠,出生的小鼠即为Slfn4基因敲除的F0代小鼠。
2.根据权利要求1所述的Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法,其特征在于,Slfn4基因敲除小鼠的基因型鉴定的引物如下所示:Slfn4‑GeneTy‑F:5’‑ TCGGAGAGAAGACTAGGGATTCA‑3’;
Slfn4‑GeneTy‑R:5’‑ GCAGAAACAGTTTGAGGGAGG‑3’。
3.根据权利要求2所述的Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法,其特征在于,采用琼脂糖凝胶电泳对Slfn4基因型进行分析。
4.利用如权利要求1所述的构建方法得到的Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠在研究动脉粥样硬化疾病发生、发展方面的应用。
5.Slfn4作为药物靶标在筛选治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。
6.Slfn4抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。