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专利号: 2018100653684
申请人: 新乡医学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-04-09
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型的制备方法,其特征在于:包括:将NOD小鼠中ApoE基因和LDLR基因同时敲除后,即得。

2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:在敲除所述ApoE基因时采用CRISPR/Cas9系统,选择3个靶序列,分别如下所示:ApoE-sgRNA1:5‘-CCTAGCCGAGGGAGAGCCGG AGG-3’;

ApoE-sgRNA2:5‘-GTAATCCCAGAAGCGGTTCAGGG-3’;

ApoE-sgRNA3:5‘-CTTCTGGGATTACCTGCGCT GGG-3’。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:在敲除所述LDLR基因时采用CRISPR/Cas9系统,选择3个靶序列,分别如下所示:LDLR-sgRNA1:5‘-TCCATCACACACAAACTGCG GGG-3’;

LDLR-sgRNA2:5‘-AGTTGCAGCGGAAGTGGGCG GGG-3’;

LDLR-sgRNA3:5‘-CAGTCTTTGGGCCTGCGACG GGG-3’。

4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:在共同敲除ApoE基因和LDLR基因时,合成7条引物,通过PCR扩增得到6个双链DNA;将所述6个双链DNA转录成6个sgRNAmRNA,将所述6个sgRNAmRNA与Cas9mRNA共同注射入小鼠受精卵细胞中,得到双基因敲除受精卵细胞;

将所述双基因敲除受精卵细胞移植进入假孕雌鼠输卵管,出生后获得F0小鼠;

所述引物分别如下所示:

ApoE-IVT-1:TTAATACGAC TCACTATAGG GCCTAGCCGA GGGAGAGCCG GGTTTTAGAG CTAGAAATAG CAAG;

ApoE-IVT-2:TTAATACGAC TCACTATAGG GGTAATCCCA GAAGCGGTTC AGTTTTAGAG CTAGAAATAG CAAG;

ApoE-IVT-3:TTAATACGAC TCACTATAGG GCTTCTGGGA TTACCTGCGC TGTTTTAGAG CTAGAAATAG CAAG;

LDLR-IVT-1:TTAATACGAC TCACTATAGG GTCCATCACA CACAAACTGC GGTTTTAGAG CTAGAAATAG CAAG;

LDLR-IVT-2:TTAATACGAC TCACTATAGG GAGTTGCAGC GGAAGTGGGC GGTTTTAGAG CTAGAAATAG CAAG;

LDLR-IVT-3:TTAATACGAC TCACTATAGG GCAGTCTTTG GGCCTGCGAC GGTTTTAGAG CTAGAAATAG CAAG;IVT-R:AAAAAAGCACCGACTCGGTGCC;

将所述IVT-R分别与ApoE-IVT-1、ApoE-IVT-2、ApoE-IVT-3、LDLR-IVT-1、LDLR-IVT-2或LDLR-IVT-3组合后用于PCR扩增,获得6个双链DNA。

5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述Cas9mRNA为由pST1374-cas9载体经Agel酶线性化后,在体外转录获得。

6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述PCR扩增时,采用的模板为pX330质粒。

7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:将所述双基因敲除受精卵细胞移植至假孕雌鼠,得到F0小鼠后,鉴定选择ApoE和LDLR双基因同时敲除的F0小鼠与NOD小鼠交配得到F1代杂合子小鼠,再在将F1代杂合子小鼠进行自交,筛选出ApoE和LDLR双基因同时敲除的纯合子个体即为NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型。

8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于:所述ApoE基因的鉴定使用如下引物:ApoE-F PCR-F:5‘-CGAGGGTGAAAGAGCTGGAC-3’;

ApoE-F PCR-R:5‘-GCCTCCAGACCCACTTCAAA-3’。

9.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于:所述LDLR基因的鉴定使用如下引物:LDLR-F PCR-F:5‘-AGACGTGCTCCCAGGATG-3’;

LDLR-F PCR-R:5‘-GTTCTGTGGCCACTCATCG-3。

10.如权利要求1所述的制备方法得到的NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型在动脉粥样硬化的基础理论研究中的应用。